PARP-1抑制剂对骨肉瘤细胞生物学活性的影响及其联合顺铂对骨肉瘤细胞生长的抑制作用

摘要

第一部分
　　 目的:探讨PARP-1 抑制剂3-aminobenzamide(3-AB)对骨肉瘤细胞U2OS 及MG63 增殖及凋亡的影响。
　　 方法:
　　 1.用含10％胎牛血清的McCoy's 5a Medium Modified 培养基培养U2OS细胞，含10％胎牛血清的DMEM 培养基培养MG-63细胞，铺满瓶底后传代；
　　 2.将U2OS细胞种于96 孔板，设6组：空白组、对照组、5mM 3-AB 刺激组、10 mM3-AB 刺激组、15mM 3-AB 刺激组、20mM 3-AB 刺激组，每组4个复孔，种3块板，分别给予刺激24、48、72 h，按CCK-8 法检测细胞增殖，计算抑制率；
　　 3.将MG-63细胞种于96 孔板，设5组：空白组、对照组、5mM 3-AB 刺激组、10 mM3-AB 刺激组、20mM 3-AB 刺激组，每组4个复孔，种3 块板，分别给予刺激24h、48h、72 h，按CCK-8 法检测吸光度值，计算细胞增殖抑制率；
　　 4.将U2OS细胞种于6 CM 培养皿中，接种6个皿，其中3 皿作为对照组给予完全培养基培养，另3 皿在培养基中加入10mM的3-AB，分别在培养24h、48h、72h后每组各取一皿，按Annexin V-FITC 凋亡试剂盒说明书操作，上流式细胞仪测凋亡率；
　　 5.将MG-63细胞种于6 CM 培养皿中，接种8个皿，其中2 皿作为对照组给予完全培养基培养，另6 皿在培养基中分别加入5mM、10mM、20mM的3-AB，在培养24h、48h后每组各取一皿，按Annexin V-FITC 凋亡试剂盒说明书操作，上流式细胞仪检测细胞凋亡率；
　　 6.将U2OS细胞种于6CM的培养皿中，接种4个皿，其中一皿作为对照组，另三皿分别给予10mM的3-AB 刺激8h、12h、24h后，按caspase-3 活性测定试剂盒说明书提取蛋白测定caspase-3的活性；
　　 7.将U2OS细胞种于6CM的培养皿中，接种4个皿，一皿作为对照，给予完全培养基培养，另三皿培养基中加入10mM的3-AB，分别培养24h、48h、72h后提取细胞总蛋白，Western-blotting 检测Bcl-2、Bax的表达。
　　 结果:
　　 1.3-AB 抑制骨肉瘤细胞U2OS的增殖，抑制率随3-AB 浓度的升高而升高，随时间的延长而升高；
　　 2.3-AB 抑制骨肉瘤细胞MG-63的增殖，抑制率随3-AB 浓度的升高而升高，随时间的延长而升高；
　　 3.3-AB 促进骨肉瘤细胞U2OS的凋亡，凋亡率随3-AB 刺激时间的延长而升高；
　　 4.3-AB 促进骨肉瘤细胞MG-63的凋亡，凋亡率随3-AB 浓度的升高而升高，随时间的延长而升高；
　　 5.3-AB 刺激8h、12h后caspase-3 活性增加，差异有显著性，24h后caspase-3 活性与对照组比较无显著性差异；
　　 6.3-AB 刺激24h、48h、72h后，Bax表达量逐渐升高，Bcl-2表达量则在24h 及48h轻度升高，72h 降低。
　　 结论:PARP-1 抑制剂3-AB 能抑制骨肉瘤细胞的增殖，促进其凋亡。
　　 第二部分
　　 目的:探讨PARP-1 抑制剂3-aminobenzamide(3-AB)对骨肉瘤细胞U2OS 迁移及侵袭的影响。
　　 方法:
　　 1.常规培养U2OS细胞，铺满瓶底后传代；
　　 2.将U2OS细胞种于6 孔板中，待细胞铺满孔底后用枪头在孔板底划三道划痕，PBS冲洗三次，然后将孔分为3组，分别给予完全培养基、含5mM 3-AB的培养基和含10mM 3-AB的培养基继续培养，24h后观察细胞迁移的距离；
　　 3.将U2OS细胞分为两组，一组为对照组，给予完全培养基培养，另一组给予10mM3-AB 处理24h，然后将细胞消化后重悬于含0.1％ BSA的无血清培养基中，加入铺好matrigel的Transwell 小室的上室，下室加入完全培养基，24h后棉棒除去基质胶，染色，显微镜下观察穿过膜的细胞数。
　　 结果:
　　 1.3-AB 刺激后较对照组细胞迁移距离降低，且随3-AB 浓度增加，迁移距离降低越明显，差异有显著性；
　　 2.3-AB 刺激后较对照组细胞穿过基底膜数量减少，差异有显著性。
　　 结论:
　　 PARP-1 抑制剂3-AB 能抑制骨肉瘤细胞的迁移及侵袭能力。
　　 第三部分
　　 目的:探讨PARP-1 抑制剂3-aminobenzamide(3-AB)联合顺铂对骨肉瘤细胞U2OS 生长的影响。
　　 方法:
　　 1.常规培养U2OS细胞，铺满瓶底后传代；
　　 2.将U2OS细胞接种于两块96 孔板中，分为顺铂处理板及顺铂联合3-AB 处理板，每板设七组，分别为空白组、对照组、0.5μg/ml 顺铂加或不加3-AB组、1.0μg/ml顺铂加或不加3-AB组、1.5μg/ml 顺铂加或不加3-AB组、2.0μg/ml 顺铂加或不加3-AB组、2.5μg/ml 顺铂加或不加3-AB组，分别在刺激48h后用CCK-8 法测吸光度值，并计算细胞存活率；
　　 3.将U2OS细胞接种于6CM 皿中，接种12个皿，分为4组：阴性对照组、3-AB 处理组、顺铂处理组、3-AB 联合顺铂处理组，每组3 皿，分别在培养24h、48h、72h后收集细胞，PI 染色，上流式细胞仪检测细胞凋亡及细胞周期的变化。
　　 结果:
　　 1.单纯顺铂处理及与3-AB 联合处理后细胞的存活率均随顺铂浓度的增高而逐渐降低，单纯顺铂处理IC50 为1.15003，联合刺激组的IC50 为0.65254，增敏比为1.76；
　　 2.与对照组比较，经单纯3-AB 处理，及3-AB与顺铂联合处理后细胞的凋亡率均增加，而3-AB 联合顺铂处理后细胞的凋亡率较单纯3-AB 及单纯顺铂处理的凋亡率高；
　　 3.与对照组比较，3-AB 处理组细胞周期无明显改变，顺铂处理组24h后细胞周期呈S 期阻滞，而后转为G2/M 期阻滞，而3-AB 联合顺铂处理组S 期阻滞时间更长，持续至72h。
　　 结论:PARP-1 抑制剂3-AB 能增强顺铂对骨肉瘤细胞的增殖抑制及促凋亡作用。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略词表

声明

引 言

第一部分 PARP-1 抑制剂对骨肉瘤细胞增殖凋亡的影响

第二部分PARP-1 抑制剂对骨肉瘤细胞侵袭的影响

第三部分PARP-1 抑制剂联合顺铂对骨肉瘤细胞的影响

全文总结

参考文献

综述1:PARP 的研究进展：结构及其功能

综述2:PARP-1 抑制剂的研究进展

附 录:攻读学位期间发表论文

致 谢