Eya1调节CyclinD1促进乳腺癌细胞增殖的机制研究

摘要

第一部分
　　 目的:探讨蛋白Eya1在乳腺癌细胞增殖中的作用。
　　 方法:选用乳腺癌细胞系MDA-MB-453，SK-BR3，BT474以及MDA-MB-231 作为研究对象。首先，在MDA-MB-453，SK-BR3以及BT474细胞系中采用慢病毒感染的方式稳定高表达蛋白Eya1，Eya1磷酸酶突变体Eya1D327A以及相应的空质粒对照；而在MDA-MB-231细胞系中，通过感染Eya1的shRNA(small hairpin RNA)慢病毒，从而获得稳定低表达蛋白Eya1的MDA-MB-231细胞系以及相应的空质粒对照。然后，在以上的高表达或者低表达蛋白Eya1细胞系中，通过MTT，细胞生长曲线，H-胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)掺入法以及细胞克隆形成实验检测Eya1对乳腺癌细胞增殖能力的影响。
　　 结果:首先在乳腺癌细胞系MDA-MB-453，SK-BR3，BT474成功构建了稳定表达Eya1，Eya1磷酸酶突变体Eya1D327A以及相应的空质粒对照的稳定细胞株。然后，通过MTT比色法，细胞生长曲线检测Eya1对细胞增殖的影响。MTT实验结果表明，在MDA-MB-453细胞中，与空质粒对照相比，高表达Eya1后细胞增殖能力是空质粒组的1.5倍，而高表达Eya1磷酸酶突变体Eya1D327A组细胞无明显增殖优势。同样，在SK-BR3细胞中，与空质粒对照相比，高表达Eya1后细胞增殖能力是空质粒组的2倍，而高表达Eya1磷酸酶突变体Eya1D327A组细胞无明显增殖优势。MDA-MB-453，SK-BR3细胞生长曲线的结果表明，高表达Eya1组的细胞增殖明显高于对照组和Eya1磷酸酶突变体Eya1D327A组。H-胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)掺入的结果表明，Eya1组的细胞增殖能力大约是对照组的2倍。其次，在细胞系MDA-MB-453，SK-BR3，BT474中检测高表达Eya1对细胞克隆形成的影响。结果表明高表达Eya1组细胞克隆的数量大约是对照组的1.5-3倍。最后，在MDA-MB-231细胞中低表达Eya1，通过以上方法检测其对细胞的影响。MTT和细胞生长曲线结果均表明，低表达Eya1的细胞增殖能力与对照相比大约下降50％；H-胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)掺入的结果表明，低表达Eya1组的细胞增殖能力大约降低50％。
　　 结论:蛋白Eya1促进乳腺癌细胞增殖。
　　 第二部分
　　 目的:探讨蛋白Eya1 促进乳腺癌细胞增殖的机制。
　　 方法:在MDA-MB-453细胞中高表达蛋白Eya1，然后通过基因芯片技术筛选出表达水平变化的基因；经分析得到初步的结果后，在乳腺癌细胞系MDA-MB-453，SK-BR3，BT474以及MDA-MB-231中，从mRNA 水平和蛋白水平进一步验证基因芯片的结果；然后找出Eya1 转录调节的下游基因，通过启动子活性的检测，染色质免疫沉淀(ChIP)等实验确认Eya1 转录调节的基因；最后，通过细胞增殖相关实验如MTT，细胞生长曲线及克隆形成等，证实Eya1 依赖其转录的下游基因促进乳腺癌细胞增殖。
　　 结果：基因芯片提示，MDA-MB-453 高表达蛋白Eya1后，与细胞周期密切相关的基因Cyclin D1 明显增加；在乳腺癌细胞系MDA-MB-453和SK-BR3中，高表达Eya1 促进Cyclin D1 mRNA的表达水平增加，而在MDA-MB-231细胞中抑制蛋白Eya1的表达后Cyclin D1的mRNA表达水平相应下降；还验证了Eya1和Cyclin D1 之间在蛋白水平表达的一致性；然后，通过对Cyclin D1 启动子活性的分析表明Eya1 增强Cyclin D1的启动子活性；染色质免疫沉淀(ChIP)实验证实Eya1 结合于Cyclin D1的启动子；在乳腺癌细胞系MDA-MB-453和SK-BR3 高表达蛋白Eya1 促进乳腺癌细胞增殖，但是抑制细胞内源性的Cyclin D1表达能完全抵消蛋白Eya1 对细胞增殖的作用；还发现蛋白Eya1促进蛋白Six1的表达，通过免疫沉淀实验证实二者具有相互作用。内源性Six1的降低后，Eya1 促进细胞增殖能力的随之降低。
　　 结论：蛋白Eya1 通过转录调节Cyclin D1促进乳腺癌细胞增殖。

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引 言

第一部分：蛋白Eya1 促进乳腺癌细胞增殖

第二部分：Eya1促进乳腺癌细胞增殖的机制研究

综 述：Eya1 参与调控果蝇复眼发育

实验常用缓冲液、试剂的配制方法1

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