高级糖化终产物诱导阿尔茨海默病样病理改变及相关机制研究

摘要

背景:过度磷酸化的tau蛋白和b-淀粉样多肽（b-amyloid，Ab）的聚积是阿尔茨海默病（alzheimer disease，AD）的两大特征性病理改变—神经原纤维缠结（neurofibrillary tangles，NFTs）和老年斑（senile plaques，SPs）的主要成分。高级糖化终产物（advanced glycation endproducts，AGEs）是蛋白质的氨基与还原糖及其衍生物的羰基发生非酶促反应后生成的不可逆的糖化产物。随着年龄的增加，AGEs的生成会逐渐增多，特别是体内血糖升高时如糖尿病患者，AGEs会显著增加。研究发现，与同龄对照组相比，AD患者或模型脑脊液和血液中AGEs水平明显升高；免疫学的证据也表明AGEs与神经原纤维缠结和老年斑共定位。以上研究提示AGEs可能是导致糖尿病患者和老年人口AD发生危险性升高的重要原因之一，但AGEs如何影响tau蛋白磷酸化、Ab代谢和脑功能及其机制，迄今为止尚不清楚。早期降低AGEs的水平是否能逆转拟AD模型鼠的AD样病理改变和空间学习记忆能力的损伤，目前也未见报道。
　　 目的:探讨AGEs对tau蛋白磷酸化和Ab代谢的影响及机制；研究AGEs对大鼠空间记忆能力的影响以及早期干预拟AD模型的AGEs生成能否预防脑结构和功能的损伤。
　　 方法:
　　 体外研究：我们采用合成的AGEs处理SK-N-SH细胞和原代海马神经元，并用高级糖化终产物受体（receptor for advanced glycation endproducts，RAGE）抗体、糖原合酶激酶-3（glycogen synthase kinase-3，GSK-3）抑制剂（SB216763，LiCl）、细胞外信号调节激酶1和2（Extracellular Signal Regulated Kinase1/2，Erk1/2）抑制剂（PD98059）或p38抑制剂（SB202190）与AGEs共处理。
　　 体内研究：我们采用立体定位注射的方法对SD大鼠双侧海马注射AGEs，合并注射RAGE抗体或GSK-3抑制剂。为研究早期干预AGEs对AD的影响，我们选用6月龄拟AD模型Tg2576小鼠，连续3个月皮下注射氨基胍（aminoguanidine，AG）或生理盐水（normal saline，NS）。
　　 采用免疫印迹或免疫组织化学检测tau蛋白磷酸化、蛋白激酶或磷酸酯酶的活性依赖性修饰以及突触蛋白的表达水平；采用酶联免疫吸附法ELISA检测Ab的水平；采用免疫共沉淀检测Ab的的糖化水平；采用长时程电位增强（long term potentiation，LTP）技术检测突触可塑性；采用转染绿色荧光蛋白检测原代海马神经元树突棘的数目和形态；采用水迷宫试验检测大鼠的空间记忆功能。
　　 结果:
　　 1）AGEs可通过RAGE/GSK-3通路诱导tau蛋白过度磷酸化。
　　 AGEs可诱导SK-N-SH细胞、原代海马神经元和SD大鼠的tau蛋白过度磷酸化。为了探讨AGEs诱导tau蛋白过度磷酸化的机制，我们用AGEs（最佳浓度50 mg/ml，最佳时间24 h）处理SK-N-SH细胞，发现AGEs在诱导tau蛋白过度磷酸化的同时，伴随有RAGE Mrna和蛋白水平的升高、Akt活性的抑制以及蛋白激酶（GSK-3、Erk1/2和p38）活性的激活，而其它蛋白激酶，如c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK），钙调蛋白激酶II（calcium calmodulin-dependent protein kinase II，CaMKII），蛋白激酶A调节亚基（regulary unit of protein kinase A Ia，PKA Ria）和PKA RIIb，以及磷酸酯酶2A（protein phosphatases 2A，PP2A）的活性无明显变化。为了进一步确定以上有活性改变的蛋白分子在AGEs诱导的tau蛋白过度磷酸化中的作用，我们采用RAGE抗体和相关蛋白激酶抑制剂与AGEs共处理，结果发现当共处理RAGE抗体或GSK-3抑制剂时可有效逆转AGEs诱导的tau蛋白过度磷酸化，而同时抑制Erk1/2或p38无明显变化，提示RAGE和GSK-3可能在AGEs诱导的tau蛋白过度磷酸化中起重要作用。
　　 2）AGEs损伤大鼠空间记忆能力，其机制涉及AGEs通过RAGE/GSK-3通路导致tau蛋白过度磷酸化、LTP抑制、突触蛋白下降、树突棘减少。
　　 我们发现，注射AGEs损伤SD大鼠空间记忆能力。为了探讨相关机制，我们检测了与空间记忆相关的指标，如tau蛋白磷酸化、LTP和突触相关蛋白。发现注射AGEs可导致tau蛋白过度磷酸化、LTP抑制、多种突触蛋白（尤其是突触后蛋白PSD95、PSD93、NR2A和NR2B）水平降低。同时，伴随有RAGE水平升高、Akt抑制和GSK-3激活。为进一步研究RAGE和GSK-3的作用，我们采用了RAGE抗体或GSK-3抑制剂与AGEs一起海马定位注射，结果发现同时阻断RAGE或抑制GSK-3可显著改善AGEs诱导的大鼠空间记忆障碍，伴随tau蛋白磷酸化、LTP和突触蛋白水平的恢复。
　　 3）早期阻止AGEs聚积可有效预防拟AD模型空间学习记忆损伤，伴随Ab和tau蛋白磷酸化水平降低、突触蛋白含量恢复。我们选择从6月龄小鼠开始皮下注射氨基胍AG。对照组注射同体积生理盐水NS。3个月后，发现给予AG可明显抑制AGEs的生成；同时，AG干预组小鼠的空间学习记忆能力改善、tau蛋白在Thr231和Ser396位点磷酸化水平降低、突触蛋白和相关记忆分子水平升高、Ab水平明显降低。用免疫共沉淀方法检测AGEs与Ab的相互作用，发现Ab可明显被AGE化。
　　 结论:
　　 1）AGEs可通过RAGE/GSK-3信号通路诱导tau蛋白过度磷酸化。
　　 2）Ab在体内可发生糖化，糖化能促进Ab的聚积。
　　 3）AGEs可通过RAGE/GSK-3信号通路诱导大鼠空间记忆能力的损伤，早期抑制AGEs生成可逆转拟AD模型Tg2576小鼠的空间学习记忆的损伤。

目录

文摘

英文文摘

声明

前　言

材料与方法

结 果

讨　论

小　结

主要创新点和下一步工作设想

参考文献

综 述 高级糖化终产物与阿尔茨海默病

附录

致 谢