Trop2基因促进小鼠心脏c-kit+细胞增殖和抗凋亡作用的研究

摘要

目的:心脏祖细胞（CPCs）是一群定居于心脏内的具有多向分化潜力的细胞，它的发现更新了心脏生物学，改变了以往所认为的心脏是一个不可再生器官的观念。然而，CPCs在心肌组织内含量极低，并且对缺血缺氧极为敏感，因此对梗死心肌组织的修复能力有限。CPCs具有多种亚型，其中c-kit+细胞被认为在心肌修复中发挥主要作用。Trop2是一种多表达于具有旺盛增殖能力的细胞膜表面的糖蛋白，活化Trop2具有促进多种细胞增殖和抗凋亡作用的效应。本研究的目的是调查具有快速扩增能力的心脏c-kit+细胞是否也表达Trop2，如果表达，Trop2的生物学效应及其相关机制。
　　 方法:
　　 一、观察小鼠心梗以后Trop2+c-kit+细胞比例变化通过建立小鼠心梗模型，分别应用免疫组织化学和流式细胞术分析心梗急性期内Trop2+c-kit+细胞的动态变化。
　　 二、细胞分离和培养利用免疫磁珠两步分离法，从正常小鼠心肌组织中分离出Trop2+c-kit+和Trop2-c-kit+细胞，并培养于合适的培养基中保持其未分化状态；
　　 三、细胞增殖实验构建Trop2 shRNA质粒，利用脂质体介导将其转染入Trop2+c-kit+细胞，Western Blot监测不同时间点Trop2表达水平，并在相应时间点应用BrdU（bromodeoxyuridine）法检测细胞增殖能力。
　　 四、细胞凋亡实验为模拟急性梗死心肌组织的炎性微环境，利用脂多糖刺激小鼠中性粒细胞，藉此产生条件化培养基，并将含有不同浓度的条件化培养基（CM）分别作用于Trop2+c-kit+细胞和Trop2-c-kit+细胞，应用Annexin V-APC/PI法检测细胞凋亡率。
　　 五、相关生物学效应机制探讨应用Western Blot和免疫复合物激酶分析技术，对可能引起Trop2相关效应的激活丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）和PI3K通路的下游分子进行检测，探索相关效应的生物学机制。
　　 六、体内观察Trop2对小鼠心脏c-kit+细胞的保护作用建立Trop2基因敲除（Trop2-/-）小鼠模型，和野生型小鼠（Trop2+/+）小鼠比较，观察心肌梗死后c-kit+细胞数量的动态变化，同时对两组小鼠进行生存分析。
　　 结果:Trop2在小鼠心肌组织中仅表达于c-kit+细胞，在正常生理状态下，Trop2+c-kit+细胞比例极低，但心肌梗死后含量迅速上升，其上升趋势和炎性细胞浸润相关。在细胞水平观察到，Trop2能促进小鼠心脏c-kit+细胞增殖和在炎性环境中的抗凋亡能力，这些效应的发生可能与MAPK通路被激活有关。整体水平亦证实Trop2能提高梗死心肌组织中c-kit+细胞的生存能力；同Trop2-/-小鼠相比，Trop2+/+小鼠在心梗急性期具有更高的存活率。
　　 结论:Trop2通过增强心脏c-kit+细胞增殖和抗凋亡能力，在心梗急性期发挥着重要的保护作用。利用基因工程的方法使外源性的心脏c-kit+细胞过表达Trop2蛋白，或者使用具有高度选择性的Trop2受体激动剂活化内源性心脏c-kit+细胞，或许可以作为一种极具潜力的治疗策略应用于急性心肌缺血的治疗。

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