轴突导向因子Netrin-1在肺癌血管拟态和血管新生中的作用及机制的初步研究

摘要

第一部分：
　　 目的：轴突导向因子Netrin-1和金属基质蛋白酶-2 （MMP-2)在肿瘤细胞的浸润、转移和肿瘤血管生成中发挥重要作用。MMP-2在血管拟态形成的通路中是关键性的因子。然而，Netrin-1与肿瘤血管拟态形成的关系还不明确。本实验研究拟探讨Netrin-1与MMP-2的关系以及Netrin-1与肺癌血管拟态（VM）形成的关系。
　　 方法：收集该院2008年5月-2009年12月手术切除的45例肺癌患者作为研究对象，以及9例良性肺部疾病患者作为对照。过碘酸雪夫反应（PAS）组织化学及CD31 免疫组织化学双重染色法检测收集的肺癌组织以及肺良性病变中血管拟态是否存在；免疫组织化学法检测组织中Netrin-1、MMP-2的表达；统计学分析Netrin-1和MMP-2的关系以及Netrin-1 阳性表达与肺癌组织中VM 现象的关系。
　　 结果：肺癌组织中Netrin-1表达的阳性率为51.1％(23/45)，MMP-2表达的阳性率为60％(27/45)，而在肺良性病的组织中Netrin-1和MMP-2表达的阳性率分别为11.1％(1/9)和22.2％(2/9)；在肺癌组织中Netrin-1和MMP-2的阳性表达率显著高于其在良性肺疾病组织中的表达（p<0.05）；在45例肺癌患者组织中，6例患者肺癌组织存在VM 现象(6/45，13.3％)，其中Netrin-1和MMP-2 均高表达；而在22例者Netrin-1表达阴性的肺癌患者的组织中，没有发现VM 现象的存在（0/22，0％）。
　　 结论：肺癌组织中存在VM 现象；存在VM 现象的肺癌组织中，轴突导向因子Netrin-1和MMP-2 均高表达，但其在VM 形成中具体的作用机制尚需进一步实验阐明。
　　 第二部分：
　　 目的：目前的研究结果表明Netrin-1 可能通过MMP-2 途径在肺癌组织血管拟态的形成中发挥作用，然而，Netrin-1 具体的作用机制尚未阐明。本实验拟通过体外研究Netrin-1 对人肺腺癌细胞株A549 血管拟态形成过程的影响，初步探讨在人肺腺癌细胞株A549 血管拟态形成过程中Netrin-1的作用机制。
　　 方法：Transwell 小室检测Netrin-1 对人肺腺癌细胞株A549 迁移能力的影响；小管形成实验检测Netrin-1 对人肺腺癌细胞A549 管道形成能力的影响；Western blot 检测Netrin-1 干预人肺腺癌细胞A549后受体DCC （deleted in colorectal cancer）表达的水平，以了解Netrin-1 对受体DCC 活性的影响；Western blot 及RT-PCR检测Netrin-1干预人肺腺癌A549细胞后MMP-2/9 活性的影响。
　　 结果：Netrin-1 干预人肺腺癌A549细胞24h后，其受体DCC表达升高，人肺腺癌细胞A549的管道形成能力、侵袭能力、迁移能力增强；Western blot以及RT-PCR检测显示其受体DCC、金属基质蛋白酶MMP-2和9 活性增强。
　　 结论：Netrin-1 可能通过增加其受体DCC的活性，增强细胞分泌MMP-2/9，增强A549细胞迁移、侵袭能力，从而增强肺癌血管拟态形成的能力，促进肿瘤生长。
　　 第三部分：
　　 目的：血管内皮生长因子（VEGF）为促血管新生最强的细胞因子，而恩度是首个抗肿瘤血管治疗的血管内皮抑素。第一、二部分实验结果表明，Netrin-1在肺癌血管拟态形成过程中起重要作用。然而，其与VEGF和血管抑素的关系不明确。本实验拟初步研究Netrin-1与VEGF以及血管内皮抑素对Netrin-1的作用，探讨Netrin-1 对肺癌新生血管形成中与血管因子的相互作用。
　　 方法：MTT 法检测恩度(0，25，50，100和125μg/m)对肺腺癌A549细胞增殖抑制率和迁移、侵袭的影响。免疫荧光细胞化学法检测恩度干预后A549细胞表达Netrin-1的水平，Western blot 法检测肺腺癌A549细胞株中Netrin-1表达情况。双抗体两步夹心酶联免疫吸附法(ELISA 法)检测Netrin-1 干预A549细胞后VEGF的表达水平。
　　 结果：恩度对肺腺癌A549细胞增殖、迁移、侵袭能力呈剂量依赖性抑制，24h的IC50 值为20.7±5.6 mol/L，48h的IC50 值为32.9±6.3 mol/L，72h的IC50 值为56.3±4.6 mol/L。恩度干预A549细胞24h后，细胞表达Netrin-1下调，A549细胞迁移、侵袭能力显著下降；而Netrin-1 干预A549细胞24h后，则可上调VEGF的表达。
　　 结论：Netrin-1 上调A549细胞VEGF的表达，提示其对血管新生可能有促进作用；而恩度则通过下调肺癌细胞表达Netrin-1，抑制肺腺癌A549细胞增殖、迁移及侵袭能力。

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文摘

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前言

第一部分

第二部分

第三部分

结 论

综 述

附 录

致谢