FTY720治疗伴C-KIT激酶区突变的急性髓系白血病的机制研究

摘要

第一部分、C-KIT/D816V 突变在急性髓系性白血病中的发生率调查
　　 目的：分析C-KIT/D816V 突变在中国人AML患者中的发生率。
　　 方法：收集2008年至2011年送至干细胞中心行C-KIT/D816V检测的AML 外周血标本286例，提取者外周血单个核细胞，采用Real-time Quantitative PCRSYBR green染料法检测C-KIT D816V突变。
　　 结果：286例AML患者中，有8例（2.8％，其中6例男性，2例女性）患者发生了C-KIT/D816V突变，其在男性患者和女性患者中的发生率分别为3.9％和1.5％，在男性患者中的发生率高于女性，差异有统计学意义（P＜0.05）。8例C-KIT 突变患者中有5例M2，1例M4，另外2例患者FAB 亚型诊断未明。在AML各亚型中的发生率分别为：M2 6.8％，M4 4.3％。
　　 结论：C-KIT/D816V突变最常发生在M2中，其次为M4。在男性患者中的发生率高于女性。本研究从流行病学的角度为C-KIT/D816V 突变在中国人AML及其亚型中的发生率提供了重要依据。
　　 第二部分、关于携带C-KIT/D816V 突变及C-KIT/WT的急性髓系白血病PP2A蛋白活性变化的研究
　　 目的：从流行病学的角度探讨携带C-KIT/D816V[位于C-KIT 激酶区（C-KIT kinasedomain，C-KIT/TKD）]突变的急性髓细胞性白血病患者及携带野生型C-KIT（C-KIT/WT）的急性髓细胞性白血病患者单个核细胞中蛋白磷酸酯酶2A(proteinphosphotase 2A，PP2A)的活性变化，并对携带C-KIT/N822K（位于C-KIT/TKD）突变的AML细胞株Kasumi-1 及携带野生型C-KIT的AML细胞株HL60中PP2A 活性进行了比较。
　　 方法：选取8例C-KIT/D816V突变的AML患者，12例C-KIT/WT AML患者及20例健康对照，提取单个核细胞，使用PP2A 免疫沉淀磷酸酶检测试剂盒检测PP2A 活性。体外培养HL60 及Kasumi-1细胞株，使用PP2A 免疫沉淀磷酸酶检测试剂盒检测PP2A 活性。使用SPSS16.0 对数据进行分析。
　　 结果：C-KIT/WT AML组患者单个核细胞PP2A的活性（565.69±1 22.56 pmol）与正常人（706.02±1 54.22 pmol）比较有所降低，而C-KIT/D816V AML组（419.01±96.97pmol）活性最低，各组之间差异有统计学意义（P<0.05）。Kasumi-1细胞PP2A 活性（886.420±152.187 pmol）与HL60细胞（1196.442±219.483 pmol）比较有所降低，差异有统计学意义（P<0.05）。
　　 结论：AML 患者PP2A 活性有所降低，且携带C-KIT/TKD的AML患者及细胞株中PP2A 活性与携带C-KIT/WT的AML 患者或细胞株比较有所降低，PP2A 蛋白活性与AML的发生、发展密切相关，对AML的诊断及治疗可能有参考价值。
　　 第三部分、FTY720 对携带C-KIT 激酶区突变的AML 体外抑制作用的机制研究
　　 目的：本研究探讨FTY720 对携带C-KIT/TKD 突变的AML细胞系Kasumi-1 及未携带C-KIT/TKD 突变的AML细胞系HL-60细胞增殖、凋亡的影响，并对FTY720 对两种细胞作用的进行了比较了，探讨其可能机制。
　　 方法：体外培养AML细胞株HL60 及Kasumi-1，使用FTY720（2.5，5，10和20μM）处理HL-60、Kasumi-1细胞24 小时，应用CCK8 试剂盒检测细胞的增殖状况。使用FTY720（10μM）处理细胞36h，应用流式细胞术检测细胞的凋亡率。使用FTY720（5μM，10μM）处理细胞5h，应用PP2A 免疫沉淀磷酸酶活性检测试剂盒测定细胞PP2A 活性。用FTY720（5μM）处理细胞5h，应用Western Blot 检测PP2A的表达水平。
　　 结果：FTY720 能有效抑制 HL60和Kasumi-1细胞的增殖，随药物作用浓度的增加，抑制作用越强，作用24h后FTY720对HL60和Kasumi-1的IC50分别为13.5μM和20μM，P<0.05，两者差异有统计学意义。FTY720 作用于HL60和Kasumi-1后，两种细胞的凋亡率均增加，且Kasumi-1的凋亡率增加更显著。FTY720 能增强HL60和Kasumi-1细胞的PP2A 活性，但不改变PP2A的表达水平。PP2A 抑制剂OA 能抑制FTY720 所致的PP2A 活性增强，同时也能减轻FTY720 所致的细胞毒性作用。FTY720 不改变PP2A的表达水平。
　　 结论：FTY720 能通过活化PP2A 抑制HL60和Kasumi-1细胞的增殖并诱导两种细胞发生凋亡，且对后者的作用强于前者。FTY720 对AML，尤其是难治性AML可能有治疗价值。

目录

文摘

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声明

前 言

第一部分 C-KIT/D816V 突变在急性髓细胞性白血病及其亚型中的发生率调查

第二部分 关于携带C-KIT/D816V突变及野生型C-KIT的急性髓系白血病PP2A 蛋白活性变化的研究

第三部分 FTY720 对携带C-KIT/TKD AML 细胞系体外抑制作用的研究

综 述AML 预后影响因素及C-KIT 激活性突变在其中的作用

附录攻读博士学位期间发表的文章

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