蛋氨酸亚砜还原酶对晶状体氧化应激的调节作用

摘要

糖尿病及其引起的并发症严重威胁人类健康,大量的研究揭示其发病与氧化应激密切相关。蛋氨酸(Met)是最容易被氧化的氨基酸之一,主要氧化产物是蛋氨酸亚砜(MetO),在严重的核性白内障中,核蛋白中45％的Met残基表现为氧化亚砜形式。MetO能够被蛋氨酸亚砜还原酶(Msrs)修复还原为Met,其中,MsrB1是哺乳动物Msrs家族中唯一一个硒蛋白。已有研究证实Msrs在维持晶状体细胞活力方面具有重要作用,但它们在糖尿病性白内障发生发展中的作用鲜见报道。
　　本文以链脲佐菌素(STZ)诱发的糖尿病小鼠的晶状体和人眼晶状体上皮细胞系(HLECs)SRA01/04为研究对象,观察了Msrs在小鼠晶状体和HLECs中的表达,特别是通过RNA干扰对MsrB1进行基因沉默,探讨了MsrB1这一Msrs中唯一的硒蛋白在保护HLECs氧化损伤、调控细胞凋亡等方面的作用,主要研究结果如下:
　　(1)使用光学显微镜、非变性电泳、RT-PCR、real-time PCR、蛋白免疫印迹、高效液相色谱法等方法对STZ诱发糖尿病10天小鼠的晶状体中相关生化指标进行了研究。糖尿病组中,晶状体纤维排列规律,无明显的形态学变化,40kDa大小的蛋白质含量明显下降,55kDa左右的蛋白含量略有升高趋势;四种Msrs在mRNA上的表达水平,MsrB1的蛋白质表达水平显著下降;总蛋白中MetO水平、脂质过氧化产物戊二醛(MDA)水平,蛋白羰基(PC)水平均显著升高,晶状体组织中总巯基(TSH)含量显著降低,MetO、MDA、PC和TSH的水平相应变化表明糖尿病小鼠晶状体受到氧化损伤,生物大分子发生氧化修饰,这与糖尿病小鼠晶状体Msrs表达受到抑制、抗氧化能力下降,对Met损伤的修复功能受到影响的结果相一致。这些结果说明STZ诱发的糖尿病小鼠中,在糖尿病的早期,晶状体中以Msrs为代表的氧化还原修复酶表达下降,对其抗氧化能力造成影响,晶状体受到氧化损伤。
　　(2)采用real-time PCR、免疫印迹、流式细胞术、ELISA等方法对高糖刺激或/和MsrB1基因沉默的HLECs凋亡的影响和机理进行了研究。高糖和MsrB1的分别处理均降低了细胞存活率;在高糖组中,MsrB1在mRNA和蛋白上的表达降低,高糖与MsrB1基因沉默共同作用引起胞内活性氧(ROS)和MDA水平的显著升高;在高糖组、MsrB1基因沉默组和高糖刺激的MsrB1基因沉默组 HLECs中观察到凋亡小体的出现,流式细胞术定量分析的结果证实细胞凋亡率显著增加;高糖和MsrB1基因沉默引起线粒体膜压的下降,细胞线粒体中重要的凋亡介导分子——线粒体细胞色素c向胞质释放加剧,凋亡调控关键酶caspase-3酶活显著升高。以上结果表明高糖和MsrB1基因沉默引起了细胞凋亡,且凋亡过程可能是通过胞内ROS对线粒体的损伤所介导,可见MsrB1对晶状体上皮细胞氧化还原平衡有重要的调节作用。
　　(3)采用透射电镜、荧光比色、real-time PCR、免疫印迹、ELISA等方法,观测了硒对HLECs中MsrB1表达和氧化应激的调控。亚硒酸钠的预处理对高糖和MsrB1基因沉默后线粒体正常形态的维持有显著作用;有效降低了高糖和MsrB1基因沉默而引起的ROS和MDA水平的升高,提高了MsrB1在mRNA和蛋白水平上的表达,抑制了线粒体细胞色素c的释放,减少了MsrB1基因沉默组和高糖刺激的MsrB1基因沉默组中凋亡小体的数量。以上结果表明,补硒通过提高 MsrB1等硒蛋白的表达,在维持细胞活力、抵御氧化损伤方面起到重要作用。

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1 绪论

1.1 引言

1.2 糖尿病分类

1.3 氧化损伤在糖尿病并发症中的作用

1.4 糖尿病性白内障

1.5 蛋氨酸亚砜还原酶

1.6 问题提出和研究内容

参考文献

2 链脲佐菌素诱发糖尿病小鼠的晶状体中Msrs表达的变化和

2.1 引言

2.2 材料与方法

2.3 结果

2.4 讨论

2.5 本章小结

参考文献

3 MsrB1基因沉默对高糖诱发的眼晶状体上皮细胞凋亡的影响

3.1 引言

3.2 材料与方法

3.3 结果

3.4 讨论

3.5 本章小结

参考文献

4 硒对HLECs中MsrB1表达和氧化应激的调控

4.1 引言

4.2 材料与方法

4.3 结果

4.4 讨论

4.5 本章小结

参考文献

5 全文总结

5.1 主要研究结果

5.2 主要创新点

5.3 课题展望

致谢

附录1 攻读博士学位期间完成的主要论文

附录2 主要缩写词表（按字母顺序）