持续压力对兔椎间盘髓核细胞线粒体及细胞外基质合成代谢的影响

摘要

本文主要从以下几个部分展开论述：
　　第一部分 原代椎间盘髓核细胞的体外分离及培养
　　㈠原代脊索细胞的体外分离及培养
　　目的:建立体外兔椎间盘脊索细胞的藻酸盐凝胶培养模型,并观察其形态及生物学特点。
　　方法:胶原酶消化法及不连续密度梯度离心法体外分离收集原代椎间盘脊索细胞,于1.2％低粘度藻酸盐凝胶中进行培养。倒置相差显微镜下观察细胞形态、Ⅱ型胶原免疫荧光染色进行细胞表型初步鉴定,并分别以死活细胞染色及活细胞计数试剂盒(CCK-8法)检测细定胞在藻酸盐凝胶中的存活情况及细胞增殖能力。
　　结果:成功分离获得原代椎间盘脊索细胞,其可稳表达Ⅱ型胶原。原代细胞在藻酸盐凝胶中生长良好,但增殖缓慢。
　　结论:初步了解兔椎间盘脊索细胞体外生物学特性,为椎间盘退变机制及组织工程学髓核种子细胞的研究提供了一定的实验依据。
　　㈡原代软骨样细胞的体外分离培养及共培养体系的建立
　　目的:观察非接触共培养条件下脊索细胞对软骨样细胞增殖及生物学特性的影响。方法:无菌条件下取4周龄日本大白兔胸腰段脊柱,获取髓核组织,酶消化法及不连续密度梯度法分离纯化的脊索细胞及软骨样细胞。取第2代软骨样细胞与脊索细胞按1:1的比例接种于共培养装置 Transwell小室中,单层培养的软骨样细胞设为对照组。培养1,3,7和10d后倒置相差显微镜下观察细胞生长状况,免疫荧光法鉴定细胞表型,CCK-8法测定细胞增殖,RT-PCR检测Ⅱ型胶原、蛋白多糖的表达。
　　结果:成功地分离纯化获取脊索细胞及软骨样细胞。镜下观察见原代脊索细胞体积较大,呈圆形或椭圆形,直径10～15μm,胞浆内含较多大小不等的囊泡;原代贴壁的软骨样细胞体积较脊索细胞小,呈短梭形,直径4～6μm。随着非接触共培养时间的延长,软骨样细胞增殖明显加快,以共培养7,10d明显(P<0.05);Ⅱ型胶原、蛋白多糖的表达量也逐渐增高。
　　结论:脊索细胞能促进髓核软骨样细胞的增殖,其可能在阻止椎间盘退变的发生中具有一定意义。
　　第二部分 持续压力对体外单层培养兔椎间盘髓核细胞线粒体及细胞外基质合成代谢的影响
　　目的:本研究的目的在于观察线粒体途径是否参与了压力诱导的兔髓核细胞凋亡这一病理过程中。
　　方法:可控加压装置用于观察持续压力(压力强度为1.0Mpa)对单层培养髓核细胞行压力负荷6,12,18,24及36h后造成的生物学效应。细胞活力情况通过细胞计数试剂盒 CCK-8检测,细胞凋亡率通过流式细胞仪进行分析,倒置相差显微镜观察细胞的形态学改变,凋亡相关的基因和蛋白表达分别通过实时荧光定量(Real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)PCR和Western-blot来进行分析。Western-blot检测细胞外基质Ⅱ型胶原和蛋白多糖的蛋白表达。细胞线粒体功能主要通过线粒体膜通透孔、活性氧及线粒体膜电位进行分析。
　　结果:该压力强度在上述时间点内能使细胞活力明显降低、细胞外基质Ⅱ型胶原和蛋白多糖的蛋白表达减少,且能诱导兔椎间盘髓核细胞发生凋亡改变。而且该压力能显著抑制髓核细胞线粒体功能,表现为细胞线粒体膜通透孔的开放、活性氧的过度产生及线粒体膜电位的降低。
　　结论:该压力不仅能抑制髓核细胞细胞外基质蛋白合成代谢,而且还诱导髓核细胞凋亡。且其诱导的髓核细胞凋亡可能部分通过线粒体凋亡途径所介导。线粒体途径介导的髓核细胞凋亡可能是椎间盘发生退行性改变的重要机制。
　　第三部分 持续压力对体外藻酸盐凝胶立体培养兔椎间盘髓核细胞线粒体及细胞外基质合成代谢的影响
　　目的:本研究通过建立兔椎间盘髓核细胞藻酸盐凝胶立体培养模型,观察压力干预对髓核细胞线粒体功能及相关基因表达的影响。
　　方法:将髓核细胞置于1.2％的低粘度藻酸盐凝胶中进行立体培养,再行压力干预12,24,36,40及48 h后观察相应的生物学效应。如酶标仪检测细胞线粒体脱氢酶活性,相关的基因表达通过实时荧光定量 RT-PCR来进行分析。
　　结果:该压力强度在上述时间点内能降低兔椎间盘髓核细胞细胞外基质蛋白多糖mRNA的表达,且能诱导凋亡的发生。此外该压力能显著抑制髓核细胞线粒体功能,表现为线粒体脱氢酶活性的降低。
　　结论:该压力能抑制椎间盘髓核细胞细胞外基质的合成代谢及线粒体脱氢酶活性,且能诱导髓核细胞发生凋亡。线粒体途径可能参与了压力诱导的髓核细胞凋亡过程中。

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第一部分 原代椎间盘髓核细胞的体外分离及培养

材料与方法

结 果

讨 论

参考文献

附 图

第二部分 持续压力对体外单层培养兔椎间盘髓核细胞线粒体及细胞外基质合成代谢的影响

材料与方法

结 果

讨 论

参考文献

附 图

第三部分 持续压力对体外藻酸盐凝胶立体培养兔椎间盘髓核细胞线粒体及细胞外基质合成代谢的影响

材料与方法

结 果

讨 论

参考文献

附 图

综述 一

1 椎间盘细胞

2 干细胞

参考文献

综述 二

1椎间盘退变的体内动物模型研究

2 椎间盘退变的体外模型研究

3 自发性腰椎间盘退变模型

4 结语

参考文献

附录 攻读博士学位期间论文发表及参与科研情况

致谢