表面修饰煅烧骨的制备及其在体外体内的成骨实验研究

摘要

本文主要从以下几个部分展开论述：
　　第一部分 表面矿化修饰煅烧骨的制备及其理化性质和生物相容性的研究
　　目的：探讨一种新的仿生骨材料表面修饰煅烧牛松质骨的制备方法,以提高煅烧牛松质骨作为组织工程骨的活性。
　　方法：将制备好的大小一致的煅烧牛松质骨随机分成两组,分别浸泡在配制好的单倍模拟体液(SBF)和1.5倍 SBF中。每组材料的浸泡时间均为三个时间点分别为7d、14d、21d。浸泡结束后取出煅烧骨材料烘干,然后每组材料每个时间点取样喷金,用扫描电镜(SEM)观察材料表面形态并分析材料表面矿化成分。通过比较选出效果最理想的表面修饰煅烧牛松质骨材料,研究其孔径、孔隙率、抗压和抗折强度等理化性质,并与未经表面修饰的煅烧骨材料进行比较。初步评价其生物相容性。
　　结果：EM对两组各个时间点进行表面观察与分析显示,浸泡在1.5倍 SBF里面的材料7d后表面可见有散在的类骨磷灰石,14d时表面可见类骨磷灰石层较完整、均一,21d时材料表面类骨磷灰石层凌乱并有裂纹,而浸泡在单倍 SBF的煅烧骨材料在浸泡7d、14d、21d后表面形成的类骨磷灰石均较少。在1.5倍 SBF中浸泡14d后的煅烧骨材料在理化性质方面与未经表面矿化的煅烧骨未见明显差别,其生物相容性能良好。
　　结论：煅烧骨材料在1.5倍模体液中浸泡14d可以获得最佳表面修饰效果,同时保留了原有煅烧骨材料的基本理化特性,具有良好的生物相容性。
　　第二部分 表面矿化修饰煅烧骨/BMP-2活性多肽仿生骨材料对小鼠MC3T3-E1粘附、增殖和向成骨方向分化的研究
　　目的：构建表面矿化修饰煅烧骨/BMP-2活性多肽仿生骨材料,评价表面矿化修饰煅烧骨/BMP-2活性多肽仿生骨材料对小鼠MC3T3-E1细胞的粘附、增殖和诱导成骨分化的影响。
　　方法：对煅烧骨材料进行表面改性以提高煅烧骨支架材料的骨传导活性与骨诱导活性。将制备好的表面矿化修饰煅烧骨直接与本课题组自主设计并研制的BMP-2活性多肽(P24)进行复合,构建表面矿化修饰煅烧骨/BMP-2活性多肽仿生骨材料。检测 P24在表面矿化修饰煅烧骨支架材料中的释放情况。实验分三组:A组为表面矿化修饰煅烧骨/BMP-2活性多肽材料,B组为表面矿化修饰煅烧骨材料,C组为单纯的煅烧骨材料。分别将小鼠MC3T3-E1细胞种植在三种材料表面,测定细胞与材料到粘附率。四甲基偶氮唑蓝微量酶反应比色法(MTT)和扫描电镜(SEM)检测小鼠MC3T3-E1细胞体外增殖活性,同时通过检测碱性磷酸酶(ALP)活性,ALP染色和钙结节茜素红染色了解小鼠MC3T3-E1细胞成骨分化情况。
　　结果：体外缓释试验证实 P24在表面矿化修饰煅烧骨表面具有缓慢释放特性。细胞粘附率,MTT试验和SEM检测显示,小鼠MC3T3-E1细胞在表面矿化修饰煅烧骨/BMP-2活性多肽仿生骨材料表面的粘附性能和增殖能力明显高于表面矿化修饰煅烧骨和单纯的煅烧骨材料,同时表面矿化修饰煅烧骨材料组高于单纯的煅烧骨材料组,组间差异具有统计学意义(P<0.05)。ALP活性检测显示:P24诱导的A组 ALP活性明显高于 B组和C组,B组高于 C组。ALP染色和钙结节茜素红染色:P24诱导的A组出现阳性表现的时间最早。
　　结论：表面矿化修饰煅烧骨能促进小鼠MC3T3-E1细胞在骨基质材料表面的粘附与增殖并能较好地保持细胞的形态。表面矿化修饰煅烧骨是活性多肽 P24较理想的一种载体材料,有利于充分发挥 P24的成骨活性。
　　第三部分 BMP-2活性肽/鼠尾 Ⅰ型胶原复合物植入异位成骨的实验研究
　　目的：用动物实验的方法验证鼠尾 Ⅰ型胶原支架与自行研制合成的BMP2活性多肽复合后诱导异位成骨的能力与作用。
　　方法：自行提取鼠尾 Ⅰ型胶原以及与 BMP2活性多肽复合冻干后低真空模式下电镜观察胶原结构。实验分2组。对照组:单纯鼠尾 I型胶原组;实验组:BMP2活性多肽/鼠尾 Ⅰ型胶原复合物组。将24只 SD大鼠随机分成2组,对照组6只,实验组18只。每只大白鼠右侧大腿作2cm的切口,制备股四头肌肌袋模型,将上述材料分别植入肌袋。术后第3,6周分别作放射学检查(X-ray,CT),第6周将所有大白鼠处死作组织学(HE和Von Kossa染色)检查。
　　结果：鼠尾 Ⅰ型胶原冻干后孔径大小合适与 BMP2活性多肽复合后无明显改变,是一种较理想的载体。术后第3,6周放射学检查可见实验组有明显的钙化影形成,且第6周成骨范围要明显大于第3周时所见,而对照组无成骨现象。术后第6周组织学观察可见实验组植入区有成骨细胞和大量新骨形成,而对照组仅见炎性细胞改变。
　　结论：鼠尾 Ⅰ型胶原是一种较好的载体支架材料,自行研制合成的BMP2活性多肽与其复合后,具有较强的异位诱导成骨能力。
　　第四部分表面矿化修饰煅烧骨/BMP-2活性多肽仿生骨材料修复兔桡骨缺损的实验研究
　　目的：探讨表面矿化修饰煅烧骨/BMP-2活性多肽仿生骨材料修复兔桡骨缺损的可行性与疗效。
　　方法：取新西兰大白兔36只,雌雄不限,随机分成三组,每组12只,建立桡骨中段10mm的临界大小骨缺损模型。A组,植入表面矿化修饰煅烧骨/BMP-2活性多肽仿生骨材料;B组,植入表面矿化修饰煅烧骨材料;C组,植入单纯的煅烧骨材料。三组材料植入前分别行电镜扫描观察。术后未行固定。术后4、8、12周行 X线观察与评分,12周时行三维 CT观察,8、12周行 HE染色与评分,12周时行 Masson染色观察,比较三组材料修复骨缺损的能力。
　　结果：电镜观察显示:三组材料均保留了天然的孔隙结构,孔径大小为200μm～850μm。A组材料可见白色絮状或纤维状活性多肽紧贴在矿化修饰煅烧骨孔壁表面, B组材料煅烧骨表面可见一层较完整、均一的类骨磷灰石层形成。X线片观察显示,4周时,A组植入材料周围骨痂较丰富,与宿主骨间界限较模糊,B组植入材料周围形成骨痂较之为少,C组植入材料与断端界限清楚,未见明显骨痂形成。8周时,A组植入材料与宿主骨间界限模糊,可见大量骨痂形成,骨缺损基本消失,材料有不同程度的吸收,B组植入材料周围骨痂形成较前增多,C组植入材料与断端界限较模糊。12周时,A组植入材料与宿主骨连接自然,骨痂开始塑形,髓腔有再通现象,B组植入材料与宿主骨愈合欠自然,材料部分吸收,C组植入材料未见明显吸收,骨缺损界限不清。X线评分显示术后4、8、12周时,A组与 B组和C组相比,具有有统计学意义( P<0.05)。术后12周时三维 CT显示,A组骨缺损基本修复,新生骨与宿主骨未见明显界限,B组新生骨与宿主骨之间断端不清,C组骨缺损尚未完全修复。组织学观察,术后8、12周时 HE染色评分示 A组骨缺损修复情况要明显优于与 B组和C组,组间具有显著差异性( P<0.05)。Masson染色结果示,12周时,A组可见植入材料与宿主骨交界处大量新生骨和板层骨形成,同时可见不规则骨髓腔和大量纤维组织形成,B组植入材料被增生纤维组织包裹,新生骨较 A组少,C组缺损区被大量纤维组织充填,新生骨明显较少,骨髓腔封闭。
　　结论：体外构建的表面矿化修饰煅烧骨/BMP-2活性多肽仿生骨材料是一种较理想的骨缺损修复支架材料,能在体内启动经典的软骨内化骨过程,促进骨缺损的修复。

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英文缩略词表（Abbreviations）

中文摘要

英文摘要

前 言

第一部分 表面矿化修饰煅烧骨的制备及其理化性质和生物相容性的研究

实验材料与方法

结 果

讨 论

参考文献

附 图

第二部分 表面矿化修饰煅烧骨/BMP-2活性多肽仿生骨材料对小鼠MC3T3-E1粘附、增殖和向成骨方向分化的研究

实验材料与方法

结 果

讨 论

参考文献

附 图

第三部分 BMP-2活性肽/ 鼠尾I型胶原复合物植入异位成骨的实验研究

实验材料与方法

结 果

讨 论

参考文献

附 图

第四部分 表面矿化修饰煅烧骨/BMP-2活性多肽仿生骨材料修复兔桡骨缺损的实验研究

实验材料与方法

结 果

讨 论

参考文献

附 图

全文小结

综述 纳米羟基磷灰石仿生骨材料的研究进展

0 引言

1 纳米羟基磷灰石的制备方法

2 纳米羟基磷灰石复合材料

3 纳米羟基磷灰石复合材料的应用前景

4 展望

参考文献

附录 攻读博士学位期间发表的文章

致谢