氧糖剥夺对Cdh1蛋白表达的影响及其在星形胶质细胞反应性增殖中的作用研究

摘要

研究背景和目的：
　　在多种中枢神经系统疾病的发生发展过程中均出现了星形胶质细胞反应性增殖这一病理过程。星形胶质细胞的反应性增殖对于神经元甚至整个中枢神经系统而言,都是有利有弊的,其综合效应更倾向于有害的方面。研究脑缺血后星形胶质细胞反应性增殖的具体机制并有效抑制其增殖,对于治疗缺血性脑损伤具有重要的价值及意义。
　　细胞周期末期促进复合物 APC及其调节亚基 Cdh1可以通过泛素化降解细胞周期蛋白从而抑制细胞增殖,同时 APC-Cdh1可以通过调节果糖-2,6-二磷酸酶3活性调控糖酵解代谢,而糖酵解代谢与细胞增殖互为促进因素,另一方面大鼠全脑缺血性损伤后海马区 Cdh1蛋白表达下降,因此我们推测,APC-Cdh1在缺血性脑损伤星形胶质细胞反应性增殖中发挥着重要作用,但其具体机制目前尚不清楚。
　　我们拟通过构建密闭缺氧小室进行氧糖剥夺的方法,在体外模拟缺血性脑损伤后星形胶质细胞的反应性增殖,并通过流式细胞技术及Realtime PCR法检测细胞周期及Cdh1 mRNA变化,以鉴定模型构建成功;通过不同程度氧糖剥夺的处理,探讨氧糖剥夺对星形胶质细胞内 Cdh1蛋白表达的影响,通过对比单纯缺氧与氧糖剥夺对Cdh1蛋白表达的影响评估糖代谢与 Cdh1蛋白表达之间的联系;通过构建表达大鼠Cdh1基因的重组慢病毒载体,调控 Cdh1活性;通过观察 Cdh1慢病毒干预对其下游底物的影响以评估其功能,通过其对星形胶质细胞反应性增殖的影响,探讨 Cdh1在星形胶质细胞反应性增殖中的作用。
　　研究方法与结果：
　　1.大鼠星形胶质细胞反应性增殖模型的构建及鉴定
　　方法:体外纯化培养大鼠大脑皮层星形胶质细胞,通过免疫组化法鉴定其纯度;构建密闭缺氧小室进行氧糖剥夺处理,通过检测不同时间点(10min,30min,1h,3h,6h,9h)小室内氧含量及小室内 Earle's平衡液的氧分压评估氧糖剥夺效果;对星形胶质细胞进行氧糖剥夺1h复氧48h处理,免疫组化双标法检测其增殖效应;星形胶质细胞氧糖剥夺3h,6h,9h后,PI单染法流式细胞仪检测细胞周期改变,Realtime-PCR法检测 Cdh1及其下游底物细胞周期蛋白 B1的mRNA表达变化。
　　结果:体外成功培育的星形胶质细胞纯度>90％;与对照组相比,缺氧小室进行氧糖剥夺各组氧分压均下降(P<0.05),与10min组相比,其余各组氧分压均下降(P<0.05),30min组与1h,3h,6h,9h组之间差异无统计学意义(P>0.05);通过氧糖剥夺1h复氧48h处理可引起星形胶质细胞的反应性增殖,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05);氧糖剥夺3h不引起细胞处于 S期的比例改变,6h,9h组处于S期的细胞明显减少(P<0.05);氧糖剥夺3h不引起细胞内 Cdh1及CyclinB1 mRNA水平的变化,6h组 Cdh1 mRNA表达下降,CyclinB1 mRNA表达增多,与对照组相比差异均有统计学意义(P<0.05)。
　　2.氧糖剥夺对星形胶质细胞内 Cdh1蛋白表达的影响及机制研究
　　方法:①体外纯化培养大鼠大脑皮层星形胶质细胞,随机分为对照组,氧糖剥夺1h复氧组,氧糖剥夺6h复氧组,对照组常氧培养,实验组分别氧糖剥夺3h或6h后复氧48h,Western blot法检测 Cdh1及其下游底物 Skp2蛋白的表达变化;②将体外纯化培养的星形胶质细胞随机分为对照组,氧糖剥夺6h组,单纯缺氧6h组,分别进行常氧,氧糖剥夺与单纯缺氧处理,6h后 Western blot法检测 Cdh1蛋白的表达变化,血糖仪检测各组培养液中葡萄糖含量的变化。
　　结果:①与对照组相比,氧糖剥夺1h复氧组,氧糖剥夺6h复氧组 Cdh1蛋白表达均下降,Skp2蛋白表达均增加(P<0.05);②与对照组相比,氧糖剥夺6h组 Cdh1蛋白表达明显下降(P<0.05),单纯缺氧6h组差异无统计学意义(P>0.05),氧糖剥夺6h组与单纯缺氧6h组两组间差异有统计学意义(P<0.05);单纯缺氧6h组细胞外液葡萄糖摄取率低于对照组(P<0.05)。
　　3.表达大鼠Cdh1基因的重组慢病毒载体的构建及鉴定
　　方法:根据大鼠Cdh1基因的核苷酸序列,合成目的基因片段并亚克隆到慢病毒表达载体 pGC-FU的Age I酶切位点间,命名为 pGC-FU-Cdh1。对 pGC-FU-Cdh1进行 PCR扩增及测序鉴定。将 pGC-FU-Cdh1脂质体法转染293T细胞,倒置荧光显微镜及Western blot检测其表达情况。慢病毒载体 LV-Cdh1的包装浓缩及滴度测定。
　　结果:重组慢病毒表达载体pGC-FU-Cdh1经PCR扩增、测序鉴定均显示有特异性基因片断,证明大鼠Cdh1基因正向插入慢病毒表达载体pGC-FU中;pGC-FU-Cdh1转染293T细胞,倒置荧光显微镜及Western blot检测到Cdh1-GFP的表达;慢病毒载体LV-Cdh1包装浓缩后,转染293T细胞,倒置荧光显微镜观测到Cdh1-GFP的表达后, Realtime PCR法测定滴度为2×108TU/ml。
　　4.慢病毒过表达 Cdh1蛋白对星形胶质细胞细胞反应性增殖作用的初步研究
　　方法:体外纯化培养大鼠星形胶质细胞:①随机分为 Cdh1慢病毒组及空病毒组,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达,Western Blot检测 Cdh1及Skp2蛋白的表达变化;②随机分为单纯氧糖剥夺/复氧组,Cdh1慢病毒干预组,空病毒干预组,氧糖剥夺1h复氧48h后,CCK-8法及免疫组化双标法检测细胞增殖的变化。
　　结果:与空病毒组相比,Cdh1慢病毒组 Cdh1蛋白表达总量增加,Skp2蛋白表达下降(P<0.05);与单纯氧糖剥夺/复氧组相比,Cdh1慢病毒干预组细胞反应性增殖受到抑制(P<0.05),空病毒组没有变化(P>0.05)。
　　研究结论：
　　①在体外成功培育成熟的星形胶质细胞;通过密闭缺氧小室成功进行氧糖剥夺处理,30min后可达稳态,并维持缺氧状态9h无差异;通过氧糖剥夺1h复氧48h处理引起星形胶质细胞的反应性增殖;星形胶质细胞反应性增殖状态不引起 Cdh1 mRNA水平的改变。
　　②氧糖剥夺后星形胶质细胞内 Cdh1蛋白表达减少,其变化与氧糖剥夺时间长短及是否复氧无关;Cdh1蛋白水平的变化与氧糖剥夺时细胞外液中缺少葡萄糖有关。
　　③成功构建表达大鼠Cdh1基因的重组慢病毒载体LV-Cdh1,包装的病毒滴度为2×108TU/ml,能在蛋白水平上调 Cdh1的表达,对其下游底物 Skp2蛋白的表达产生影响。
　　④慢病毒过表达 Cdh1蛋白对氧糖剥夺再复氧后星形胶质细胞的反应性增殖有一定的抑制作用。

目录

封面

声明

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英文缩略词表

中文摘要

英文摘要

前言

参考文献

第一部分 大鼠星形胶质细胞反应性增殖模型的构建及鉴定

引言

材 料 和 方 法

结果

讨论

参考文献

第二部分 氧糖剥夺对星形胶质细胞内Cdh1蛋白表达的影响及机制研究

引言

材 料 和 方 法

结果

讨论

参考文献

第三部分 表达大鼠Cdh1基因的重组慢病毒载体的构建及鉴定

引言

材 料 和 方 法

结果

讨论

参考文献

第四部分 慢病毒过表达Cdh1蛋白对星形胶质细胞细胞反应性增殖作用的初步研究

引言

材 料 和 方 法

结果

讨论

参考文献

综述 APC-Cdh1在缺血性脑损伤中的作用

1 APC-Cdh1在泛素－蛋白酶体系统中的作用

2 APC-Cdh1在细胞周期调控中的作用

3 APC-Cdh1在缺血性脑损伤中的作用

4 展望

参 考 文 献

综述 APC-Cdh1是联系糖酵解及细胞增殖的新枢纽

脑内的糖代谢

Pfkfb稳定性调控：糖酵解的调节关键

葡萄糖在神经元中起什么作用？

总结与展望

参 考 文 献

攻读博士学位期间发表的文章

致谢