Aβ与铁卟啉相互作用对蛋白质硝化及Aβ聚集的影响

摘要

阿尔茨海默氏病(Alzheimer’s disease,AD),又称为老年痴呆症,是目前最常见的神经退行性疾病。AD的重要病理标志是β-淀粉样蛋白(amyloidβ,Aβ)沉积及老年斑(senile plaque,SP)的形成。淀粉样蛋白级联假说指出Aβ在脑实质的沉积是导致AD的一个关键步骤。AD中蛋白质氧化和硝化水平明显增强,研究表明Aβ与之有直接的联系。然而其分子机制还不清楚。同时,AD病人脑中血红素(heme)代谢发生了明显的改变。有意思的是研究发现heme可以通过与Aβ结合而抑制Aβ的聚集,甚至解离Aβ聚集体。Aβ与heme的这种作用可能与AD中heme代谢异常以及线粒体功能受损有关。此外,Aβ-heme具有比heme更强的过氧化物酶活性。过氧化物酶可催化过氧化物氧化许多生物分子。因此,heme与Aβ的相互作用在AD中可能扮演重要角色。本文从以下四个方面对Aβ与heme的这种相互作用进行了研究:
　　(1)Aβ与heme的结合特性及对heme过氧化物酶活性的影响。选取Aβ1-40和Aβ1-42为研究对象,利用毛细管电泳前沿分析法(capillary electrophoresis-frontal analysis,CE-FA)研究了Aβ与heme相互作用的特性,测定结合位点数及结合常数。结果显示,Aβ1-42与heme的亲合力强于Aβ1-40,且Aβ1-42多一个结合位点。而Aβ1-40-heme的过氧化物酶活性强于Aβ1-42-heme。此外,聚集态的Aβ与heme作用后的过氧化物酶活性相对较低,表明Aβ促进过氧化物酶活性的作用不依赖于其聚集。然后选取了不同长度的以及定点突变的Aβ肽段,测定它们分别与heme结合后的过氧化物酶活性。结果显示Aβ的亲水N-端参与了与heme的结合,而苯丙氨酸F19和F20对Aβ-heme的过氧化物酶活性至关重要。这些研究揭示了Aβ-heme活性中心构成,可能为阐明不同的Aβ肽在体内所具有的不同生理功能提供参考。
　　(2)Heme抑制Aβ聚集及解离Aβ聚集体的机理。选取不同长度的Aβ肽段,研究Aβ亲水端及疏水端与heme的相互作用,结果显示Aβ1-16与Aβ1-40对heme过氧化物酶活性的影响有显著差异,同时Aβ1-16对heme吸收光谱的影响比较小,而Aβ1-40显著加强了heme在410nm及530nm附近的吸收。Aβ中的F19和/或F20对Aβ-heme的过氧化物酶活性具有重要影响,且F19和/或F20突变后Aβ-heme的紫外可见吸收光谱发生了明显的变化。这些都表明Aβ1-40的疏水端具有重要影响,特别是F19和/或F20。进一步研究了不同Aβ肽段的聚集特性及heme和PP的干预作用。结果表明heme与PP均能有效抑制Aβ1-40及Aβ1-40F19L和Aβ1-40F20L的聚集,而在解离这些肽段的聚集体中heme则表现出更好的效果。对于Aβ17-40聚集体的解离,heme与PP的效果没有明显的差别。这些结果表明heme抑制Aβ的聚集至少是与亲水端组氨酸结合及与疏水端苯丙氨酸共轭两者的共同结果,且两者具备其一即可有效抑制Aβ的聚集,而解离Aβ聚集体则相对较难,需要两方面同时作用。
　　(3)Aβ-heme复合物催化蛋白质硝化和氧化的活性。选取AD中硝化程度明显升高的烯醇酶及硝化损伤的重要靶点突触体为研究对象,研究了Aβ-heme催化H2O2-NO2-体系硝化和氧化蛋白质的活性。结果显示Aβ-heme催化烯醇酶及突触体蛋白硝化的能力显著强于heme,而催化烯醇酶及突触体蛋白氧化的能力有所降低。表明Aβ改变了heme催化蛋白质氧化损伤的形式Aβ-heme-H2O2-NO2-处理的烯醇酶的活性明显高于heme-H2O2-NO2-处理的,表明Aβ-heme导致的蛋白质氧化形式的改变在一定意义上具有保护作用。而Aβ1-40-heme与Aβ1-42-heme相比,在促进硝化及抑制氧化能力方面都有所不同,揭示Aβ1-40和Aβ1-42在体内可能具有不同的生理影响。
　　(4)Aβ-heme复合物催化蛋白质硝化的位点选择性。选取烯醇酶作为靶蛋白,利用液质联用技术检测了Aβ1-40-heme、Aβ1-42-heme与heme催化的蛋白质硝化的位点,结果显示heme主要催化疏水环境中的酪氨酸Y12发生硝化,而Aβ1-40-heme及Aβ1-42-heme则选择性地硝化烯醇酶亲水环境中的Y191及Y426,表明Aβ与heme的结合改变了heme催化蛋白质硝化的位点选择性。为了进一步研究这种硝化位点的改变与Aβ的亲疏水性的关系,设计了三个不同亲疏水性的Aβ肽段,研究它们与heme结合后的复合物催化GAPDH硝化的选择性。结果显示不同的Aβ-heme复合物催化GAPDH硝化的位点与Aβ的亲疏水性密切相关。同时这些复合物与GAPDH结合并引起二级结构的变化不同,这种特异性结合可能导致位点特异性地催化产生活性氮物种,进而导致附近的酪氨酸优先被硝化。这些研究有利于阐明Aβ-heme在催化蛋白质选择性硝化中的作用,同时为研究蛋白质选择性硝化的规律提供参考。

目录

封面

声明

中文摘要

英文摘要

目录

1 绪论

1.1 引言

1.2 老年痴呆症与β-淀粉样蛋白

1.3 β-淀粉样蛋白-铁卟啉复合物

1.4 蛋白质氧化与蛋白质酪氨酸硝化

1.5 蛋白质酪氨酸硝化的位点选择性

1.6 本文的研究目的与内容

参考文献

2 Aβ与heme的结合特性及对heme过氧化物酶活性的影响

2.1 引言

2.2 材料与方法

2.3 实验结果

2.4 讨论

2.5 本章小结

参考文献

3 Heme抑制Aβ聚集及解离Aβ聚集体的机理

3.1 引言

3.2 材料与方法

3.3 实验结果

3.4 讨论

3.5 本章小结

参考文献

4 Aβ-heme复合物在催化蛋白质硝化和氧化中的作用

4.1 引言

4.2 材料与方法

4.3 实验结果

4.4 讨论

4.5 本章小结

参考文献

5 Aβ-heme复合物催化蛋白质硝化的位点选择性

5.1 引言

5.2 材料与方法

5.3 实验结果

5.4 讨论

5.5 本章小结

参考文献

6 全文总结

6.1 本论文的主要研究成果

6.2 本论文的创新之处

6.3 课题展望

致谢

附录1 攻读博士学位期间完成的主要论文

附录2 主要缩写词表（按字母顺序）