siRNA分子干扰铜绿假单胞菌MexAB-OprM外排泵MexB基因表达的效应研究

摘要

目的: MexAB-OprM外排泵系统在铜绿假单胞菌多重耐药中起着重要的作用,本研究旨在探讨 RNA分子干扰铜绿假单胞菌 MexAB-OprM外排泵 MexB基因效应的研究;观察铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)野生株和MexAB-OprM外排泵变异菌株对小鼠致病性的差异。
　　方法:设计并合成2条21bp小分子干扰RNA( small interfering RNA, siRNA)序列,构建干扰RNA表达载体,将带有siRNA质粒电转入PAO1。应用E-test方法检测PAO1抗生素MIC的变化;RT-PCR检测MexB的mRNA的表达变化。建立铜绿假单胞菌小鼠肺部感染的模型观察siRNA干扰MexB基因的效应,分别于感染后1d,2d和3d给小鼠腹腔注射美罗培南(meropenem100mg/kg,2次/d)。观察各组小鼠肺大体和镜下病理改变情况,细菌计数,检测支气管肺泡灌洗液(BALF)中白介素-1b(IL-1b)和白介素-12(IL一12)表达水平,并检测肺组织髓过氧化物酶(MPO)表达水平。同时建立铜绿假单胞菌野生株K767,铜绿假单胞菌变异株nalB和△mexB小鼠肺部感染模型,并于感染后1,2和3d应用美罗培南(meropenem100mg/kg,2次/d)治疗小鼠,治疗后第3d,7d,14d进行各组小鼠各项指标观察。
　　结果: MIC结果显示siRNA能明显提高PAO1对抗生素的敏感性。RT-PCR结果显示siRNA干扰后的PAO1MexB基因表达明显下降(p<0.05)。siRNA干扰组小鼠,感染后3d,5d,7d肺部细菌负荷明显下降。相对于siRNAnon(PAO1)组和Scrambled siRNA(阴性分子对照)组, siRNA组小鼠具有明显减轻的病理学改变。在感染早期(3d)siRNA干扰组,中性粒细胞的募集(MPO)和炎性细胞因子(IL-1b和IL-12)升高,在感染后期(7d)表达水平下降。MexAB-OprM外排泵变异小鼠感染模型的结果显示,相比于K767和nalB组,在感染早期(3d),△mexB组中性粒细胞的募集(MPO)升高,在感染后期(14d)炎性细胞因子表达水平下降。各组血清巨噬细胞炎症蛋白-2(MIP-2)的水平在感染期间均持续升高,△mexB组与K767和nalB组相比,组间差异显著,p<0.05。△mexB组细菌载量在感染后7,14d下降明显,同时△mexB组具有明显减轻的病理学改变。与K767和nalB组相比,在感染早期(3d),△mexB组中性粒细胞的募集(MPO)和炎性细胞因子(IL-1b, IL-12和TNF-a)水平明显升高,在感染后期(14d), MPO和细胞因子表达水平明显下降。三组血清巨噬细胞炎症蛋白-2(MIP-2)的水平在感染期间均持续升高,△mexB组与K767和nalB组相比,组间差异显著,p<0.05。
　　结论:siRNA可以同时抑制MexAB-OprM外排泵MexB基因的表达和铜绿假单胞菌在体外的活动。体内研究显示,siRNA能有效减少小鼠慢性肺部感染的细菌载量,以MexB为靶基因设计的siRNA分子为治疗铜绿假单胞菌慢性感染的提供新方法。本研究为慢性铜绿假单胞菌肺部感染的治疗提供了新的思路。此外,MexAB-OprM外排泵缺陷菌株△mexB组的肺部病变明显轻于nalB组,表明MexAB-OprM外排泵系统在铜绿假单胞菌慢性肺部感染发生发展中起到重要作用。
　　本文主要从以下几个部分展开论述：
　　第一部分 siRNA干扰铜绿假单胞菌MexAB-OprM外排泵mexB基因表达的体外研究
　　目的:探讨siRNA分子对铜绿假单胞菌MexAB-OprM外排泵mexB基因表达及有关功能的影响。
　　方法:针对MexB基因设计并合成2条小分子干扰RNA( small interfering RNA, siRNA)序列,将带有siRNA质粒电转入PAO1。应用E-test方法检测PAO1抗生素MIC的变化。半定量RT-PCR和定量PCR方法检测mexB的表达变化。
　　结果:经酶切鉴定siRNA表达载体构建成功,siRNA能明显提高PAO1对抗生素的敏感性,RT-PCR结果显示干扰后的PAO1mexB基因表达明显下降(p<0.05)。
　　结论: siRNA成功干扰MexAMexB-OprM外排泵MexB基因的表达,提高铜绿假单胞菌对抗生素的敏感性,本研究显示采用RNA干扰方法为临床上治疗耐药菌引起感染提供新的思路。
　　第二部分 siRNA干扰铜绿假单胞菌MexAB-OprM外排泵MexB基因表达的体内研究
　　目的:探讨siRNA分子对铜绿假单胞菌MexAB-OprM外排泵mexB基因表达及有关功能的体内研究。
　　方法:建立铜绿假单胞菌小鼠肺部感染的模型观察siRNA干扰MexB基因的效应,抗菌药物美罗培南治疗感染后小鼠,腹腔注射美罗培南(Meropenem,100mg/kg,2次/d)。观察各组小鼠肺大体和镜下病理改变情况,细菌计数,ELISA检测支气管肺泡灌洗液(BALF)中IL-1b和IL一12表达水平,同时检测肺组织MPO表达水平。
　　结果:siRNA干扰组小鼠,感染后3d,5d,7d的肺部细菌负荷明显下降。相对于siRNAnon组和Scrambled siRNA组, siRNA组小鼠具有明显减轻的病理学改变。在感染早期(3d) siRNA干扰组,中性粒细胞的募集(MPO)和炎性细胞因子(IL-1b和IL-12)升高,在感染后期(7d)表达水平下降。
　　结论:体内研究显示,siRNA能有效减少小鼠慢性肺部感染的细菌载量,以 MexB为靶基因设计的siRNA分子为治疗铜绿假单胞菌慢性感染的提供新方法。本研究为慢性铜绿假单胞菌肺部感染的治疗提供了新的思路。
　　第三部分 MexAB-OprM外排泵变异对小鼠铜绿假单胞菌慢性肺部感染中的影响
　　目的:观察铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)野生株和MexAB-OprM外排泵变异菌株对小鼠致病性的差异,了解 MexAB-OprM外排泵基因组在铜绿假单胞菌感染致病过程中的作用。
　　方法:应用E-test方法检测铜绿假单胞菌 K767(wild type)野生型, nalB(MexAB-OprM efflux mutant)突变型,△mexB(knockout strain)敲除型对不同抗生素 MIC值的变化。建立野生株 K767,nalB和△mexB(1×107CFU/ml)小鼠肺部感染模型,并应用腹腔注射美罗培南(meropenem100mg/kg,2次/d)治疗感染后小鼠,治疗后第3d,7d,14d进行各组小鼠肺脏病理学分析,细菌学,检测支气管肺泡灌洗液(BALF)中细胞因子的水平。同时检测肺组织 MPO变化,以及血清巨噬细胞炎症蛋白-2MIP-2的表达。
　　结果:E-test结果显示,相比K767和nalB菌株,△mexB菌株对抗生素亚胺培南(IP)、帕尼培南(ETP)、美罗培南(MP)的敏感性增强;三者对头孢吡肟(TM)的敏感性没有明显差异。△mexB组小鼠感染后3d,7d,14d的肺部细菌负荷明显下降,同时该组小鼠具有明显减轻的肺脏病理学改变。相比于K767和nalB组,在感染早期(3d)△mexB组,中性粒细胞的募集(MPO)升高,在感染后期(14d)炎性细胞因子表达水平下降。各组△mexB组MIP-2的水平在感染期间均持续升高,与K767和nalB组相比,组间差异显著,p<0.05。
　　结论:MexAB-OprM外排泵缺陷菌株△mexB组的肺部病变明显轻于野生铜绿假单胞菌k767和外排泵变异nalB组,这表明MexAB-OprM外排泵系统在铜绿假单胞菌慢性肺部感染发生发展中起到重要作用。

目录

封面

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目录

中文摘要

英文摘要

前言

参考文献

第一部分siRNA 干扰铜绿假单胞菌MexAB-OprM外排泵mexB基因表达的体外研究

中文摘要

英文摘要

引 言

材料和方法

结 果

讨 论

参考文献

第二部分siRNA干扰铜绿假单胞菌MexAB-OprM外排泵MexB基因表达的体内研究

中文摘要

英文摘要

引言

材料和方法

结 果

讨 论

参考文献

第三部分MexAB-OprM外排泵变异对小鼠铜绿假单胞菌慢性肺部感染中的影响

中文摘要

英文摘要

引 言

材料和方法

结果

讨 论

参考文献

综 述

摘 要

早期发现假单胞菌的小分子RNAs

假单胞菌的小分子RNAs的研究

Fur阻遏对其有负性调控作用

GacS/GacA双元素激活系统

铜绿假单胞菌的Gac/Rsm信号转导路径功能

结论和观点

参考文献

缩略词对照表

附录一

附录二

致谢