铜绿假单胞菌青霉素结合蛋白-1b与藻酸盐产生关系的探讨

摘要

【目的】利用RNA干扰技术(RNA interference,RNAi)抑制铜绿假单胞菌PBP-1b编码基因mrcB的表达,探讨PBP-1b对藻酸盐编码基因algD产生的影响,以期为临床生物被膜耐药提供新的思路。
　　【方法】采用siRNA表达载体的方法,分别设计2对靶向mrcB基因shRNA序列,构建pMF54mrcBshRNA干扰载体;将构建好的干扰载体及空载分别电转入铜绿假单胞菌中,RT-PCR筛选抑制效率高的干扰载体,并分别计算第24小时、第三天、第六天的抑制率;同时用RT-PCR的方法分别检测PAO1标准株及转化株中藻酸盐编码基因algD分别在这三个时间点内的的表达情况,通过统计学处理观察algD的表达量有无差异。
　　【结果】经DNA测序鉴定,成功构建pMF54mrcBshRNA1/pMF54mrcBshRNA2干扰载体;将pMF54mrcBshRNA1/pMF54mrcBshRNA2/pMF54电转入铜绿假单胞菌中,分别与空白组对照,RT-PCR检测第24小时mrcB表达量pMF54mrcBshRNA2有明显统计学差异。计算其第24小时、第三天及第六天的抑制率分别为26％、41%、9%。单因素方差分析示标准株的algD基因在三个时间点表达的差异有统计学意义,第三天最高;转化株的表达量,在这三个时间点都比较高,无统计学意义。在这三个时间点用T-检验分别比较标准株及转化株algD基因的表达量,第三天无统计学意义,P>0.05。
　　【结论】PAO1标准株藻酸盐编码基因algD在生物被膜形成的第三天表达量最高;基因沉默的转化株其algD的表达量在这三个时间点明显增高,且其增高的时间提前,维持时间长;分别对标准株及转化株在三个时间点的algD表达量进行统计学处理,第三天表达量无统计学意义,可能与PAO1algD的表达量在第三天最高有关;PBP-1b与藻酸盐产生关系的具体调控机制还不详,有待于进一步研究发现。

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第一部分pMF54 mrcB shRNA质粒的构建

引 言

材料与方法

结 果

讨 论

第二部分铜绿假单胞菌青霉素结合蛋白-1b与藻酸盐产生关系的研究

引 言

材料与方法

结 果

讨 论

参考文献

综 述

致谢