双孔钾通道TREK-1的表达与调控对脑缺血损伤时星形胶质细胞功能和神经元损伤的影响及机制研究

摘要

研究目的:观察双孔钾通道 TREK-1在正常和缺氧培养条件下在大鼠皮层神经细胞中的表达;同时研究 TREK-1的活性对星形胶质细胞再摄取谷氨酸、分泌释放炎症介质 S100和增殖活化等功能的影响及其在缺血缺氧损伤中的神经保护作用;为了排除通道阻断剂的非特异性作用,选择特异性的调控 TREK-1的活性,将化学合成的siRNA转染于星形胶质细胞从而特异性的抑制TREK-1的活性,为今后研究 TREK-1通道与培养的星形胶质细胞的功能提供有力的工具。
　　研究方法:离体培养大鼠皮层神经元和星形胶质细胞,并通过细胞免疫荧光染色法分别观察TREK-1在神经元和星形胶质细胞中的表达。对培养的星形胶质细胞进行缺氧干预,通过Real-time PCR、免疫荧光染色法和蛋白免疫印迹法分别在基因水平和蛋白水平检测TREK-1在星形胶质细胞缺氧不同时间点的表达变化趋势。通过TREK-1通道相对选择性的阻断剂——奎宁和布比卡因抑制缺氧和正常条件下纯化培养的星形胶质细胞中的TREK-1的活性,利用比色法观察其对星形胶质细胞再摄取谷氨酸能力的影响;通过酶联免疫吸附法(ELISA)检测TREK-1活性对缺氧诱导的星形胶质细胞释放S100的影响,通过BrdU染色和流式细胞分析术检测TREK-1活性对缺氧诱导的星形胶质细胞活化增殖的影响。建立神经元与星形胶质细胞的共培养体系,通过末端转移酶标记技术(TUNEL)来观察TREK-1通道在脑缺血损伤中的神经保护作用。将化学合成的荧光标记的dsRNA转染于纯化培养的星形胶质细胞,观察其转染效率与浓度的关系。在优化浓度下,将化学合成的3对选择特异性针对TREK-1的siRNA片段转染于星形胶质细胞,通过细胞免疫荧光染色和蛋白免疫印迹法检测,筛选出沉默效率最佳的siRNA片段。
　　研究结果:在正常培养条件下 TREK-1通道在神经元和星形胶质细胞均有表达,在缺氧损伤的早期 TREK-1在星形胶质细胞中的表达有上升趋势,随着缺血时间的增加,其表达又逐渐下降。在正常和缺氧条件下,TREK-1抑制剂奎宁(200μM)和布比卡因(500μM)均可以抑制星形胶质细胞的再摄取谷氨酸的能力,同时,还可以显著的增加缺氧诱导的星形胶质细胞分泌 S100和星形胶质细胞的活化增殖。除此之外, TREK-1抑制剂还可以增加神经元和星形胶质细胞的共培养中神经元的凋亡率。化学合成的特异性针对 TREK-1的siT2可以明显抑制星形胶质细胞中TREK-1的表达。
　　研究结论:星形胶质细胞 TREK-1的表达及活性对其平衡缓冲功能具有重要影响,是潜在的基于星形胶质细胞的脑卒中治疗靶点。选择特异性针对TREK-1的siRNA片段 siT2转染于星形胶质细胞后可以明显抑制其表达。
　　第一部分双孔钾通道 TREK-1在正常和缺氧培养条件下神经细胞中的表达
　　研究目的:研究在正常培养条件下双孔钾通道 TREK-1在大鼠皮层星形胶质细胞和神经元中的表达分布和缺氧损伤条件下其在星形胶质细胞的表达变化趋势。
　　研究方法:离体培养大鼠皮层神经元和星形胶质细胞,并分别利用MAP-2和GFAP免疫荧光染色鉴定其纯度。通过细胞免疫荧光染色法观察 TREK-1在神经元和星形胶质细胞中的表达。对培养的星形胶质细胞进行缺氧干预,通过 Real-time PCR、免疫荧光染色和蛋白免疫印迹法分别在基因水平和蛋白水平检测 TREK-1在星形胶质细胞缺氧不同时间点的表达变化趋势。
　　研究结果:利用参考文献的方法培养到纯化的神经元和星形胶质细胞,在正常培养条件下 TREK-1在神经元和星形胶质细胞均有表达,在缺氧损伤的早期 TREK-1在星形胶质细胞中的表达有上升趋势,随着缺血时间的增加,其表达又逐渐下降。
　　研究结论:TREK-1在神经元和星形胶质细胞中均有表达,星形胶质细胞中TREK-1的表达在缺氧损伤过程中发生动态变化,表现出缺氧早期上升,晚期下降的趋势。
　　第二部分双孔钾通道 TREK-1活性对星形胶质细胞功能的影响及神经保护作用的研究
　　研究目的:研究 TREK-1的活性对星形胶质细胞再摄取谷氨酸、释放炎症介质S100、增殖活化等功能的影响及其在缺血缺氧损伤中的神经保护作用。
　　研究方法:通过TREK-1通道相对选择性的阻断剂——奎宁和布比卡因抑制缺氧和正常条件下纯化培养的星形胶质细胞中的TREK-1的活性,利用比色法检测细胞培养基中的谷氨酸浓度在TREK-1通道抑制剂作用下的改变,反映其对星形胶质细胞再摄取谷氨酸能力的影响;通过酶联免疫吸附法(ELISA)检测TREK-1活性对缺氧诱导的星形胶质细胞分泌释放S100的影响,通过BrdU染色和流式细胞分析术检测缺氧条件下TREK-1通道抑制剂对星形胶质细胞的增殖活化的影响。建立神经元与星形胶质细胞的共培养体系,通过末端转移酶标记技术(TUNEL)来观察TREK-1活性对神经元凋亡的影响,探讨其在脑缺血神经损伤中的保护作用。
　　研究结果: TREK-1通道抑制剂奎宁(200μM)和布比卡因(500μM)在正常和缺氧条件下均可以抑制星形胶质细胞的再摄取谷氨酸的能力,同时还可以显著的增加缺氧诱导的星形胶质细胞分泌 S100和星形胶质细胞的增殖。除此之外,TREK-1抑制剂还可以促进神经元和星形胶质细胞的共培养中神经元的凋亡。
　　研究结论:抑制星形胶质细胞 TREK-1通道活性可以抑制其再摄取谷氨酸的能力,显著增加缺氧诱导的炎性分泌和增殖活化,进而加重缺氧条件下的神经元损伤。
　　第三部分 siRNA选择特异性抑制星形胶质细胞 TREK-1的表达
　　研究目的:化学合成的siRNA转染于星形胶质细胞从而达到选择性抑制TREK-1表达的目的,为今后研究 TREK-1通道与培养的星形胶质细胞的功能提供有力的工具。
　　研究方法:将化学合成的荧光标记的dsRNA转染于纯化培养的星形胶质细胞,观察其转染效率与浓度的关系。在该浓度下,将化学合成的3对选择特异性针对 TREK-1的siRNA片段转染于星形胶质细胞,通过免疫荧光染色和蛋白免疫印迹法检测,筛选出沉默效率最佳的siRNA片段。
　　研究结果:化学合成的siRNA在50nM时在星形胶质细胞中的转染效率较高且无明显细胞毒性;化学合成的特异性针对 TREK-1的siT2对星形胶质细胞中TREK-1的抑制最为明显。
　　研究结论:将选择特异性针对 TREK-1的siRNA片段 siT2转染于星形胶质细胞后可以明显抑制其表达。

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中文摘要

英文摘要

前 言

参考文献

第一部分 双孔钾通道TREK-1在正常和缺氧培养条件下神经细胞中的表达

中文摘要

英文摘要

引 言

材料与方法

实验结果

讨 论

参考文献

第二部分 双孔钾通道TREK-1活性对星形胶质细胞功能的影响及神经保护作用的研究

中文摘要

英文摘要

引 言

材料与方法

实验结果

讨 论

参考文献

第三部分 siRNA选择特异性抑制星形胶质细胞TREK-1的表达

中文摘要

英文摘要

引 言

材料与方法

实验结果

讨 论

参考文献

全文总结

综述 星形胶质细胞的功能及其在脑缺血损伤中的作用

一 星形胶质细胞的起源、形态和生理特征

二 星形胶质细胞主要的生理功能

三 星形胶质细胞在脑缺血损伤中可能存在的病理损伤作用

四 星形胶质细胞在脑缺血损伤中可能存在的神经保护作用

参考文献：

致谢