利用比较基因组杂交芯片(aCGH)筛选宫颈癌相关基因的研究

摘要

HPV是宫颈癌发生的重要因素,但并不是所有 HPV感染的患者都会进展为宫颈癌,因此 HPV感染后引起的肿瘤调控相关基因改变可能是 HPV感染患者进展为宫颈癌的重要原因。本研究利用高分辨率的人类全基因组比较基因组杂交芯片来检测宫颈癌组织中基因拷贝数的变化,经过 PCR,FISH,免疫组化等方面的验证,我们发现了claudin1(CLDN1)在宫颈癌组织中存在着拷贝数增加并且伴随着表达水平的增加,而且在大量临床标本的免疫组化验证中我们发现 CLDN1的表达随着 CIN到癌变的进展表达量逐渐升高,并且在有淋巴结转移的宫颈癌组织中强阳性的表达率高于无淋巴结转移的宫颈癌组织。在 SIHA细胞中利用CLDN1的正义反义表达载体研究发现CLDN1能促进 SIHA细胞的迁移和侵袭能力,并伴随着上皮细胞相关指标的下降及间质细胞相关指标的升高,同时高表达 CLDN1能促进细胞的抗凋亡能力和克隆形成能力及MMP-9的活性增强。我们的研究首次发现 CLDN1的拷贝数的增加可能通过促进 EMT及相关的抗凋亡、细胞生存能力和MMP-9活性增高来促进宫颈癌变的进展及转移,其促进 EMT的进展有可能是通过与转录因子 SNAI1和SNAI2的直接或间接作用来实现的,我们的发现为进一步阐明宫颈癌的发病机制和做好宫颈癌的提前诊断及合理化的治疗而提供一定的依据。
　　第一部分
　　利用CGH芯片检测宫颈癌组织基因组DNA的拷贝数变化
　　目的:利用比较基因组杂交芯片(aCGH)检测宫颈癌组织基因组 DNA的拷贝数变化,筛选出差异明显的兴趣片段并进行大样本的验证。
　　方法:利用显微切割技术获得术前无放疗和化疗的宫颈癌患者的癌组织,提取其DNA及相应患者外周血的基因组 DNA。将外周血基因组 DNA作为对照,利用CGH芯片检测宫颈癌组织中基因组 DNA的拷贝数变化情况。对芯片结果进行分析,并通过实时定量 PCR、FISH等方法对芯片的结果进行验证。用实时定量 PCR和免疫组化等方法检测相关兴趣基因在宫颈癌组织中的表达情况,并与患者的临床资料相结合分析,找出与宫颈癌发生发展和转移相关的重要基因。
　　结果:在宫颈癌组织中存在着大量拷贝数变化的片段和基因,其中包括拷贝数增加的3q27.3-3q29,3q23,3q24-3q26.32,Xq28,11q12.3-11q13.1,5p15.1-5p15.3,8q24.21和9q32-9q33.2等,而绝大多数染色体中均出现拷贝数减少的片段,出现频率较高的有19p13.3,11p15.4-11p15.5和20q13.3-20q13.33等。通过 PCR对16个兴趣靶基因在105例宫颈癌中进行验证,并用FISH对 TERC和CLDN1进行验证,发现与芯片的结果相一致。进一步用实时定量 PCR对 CLDN1、GPX4和SKIL等基因进行表达水平验证,发现其趋势与基因组拷贝数变化相一致。在临床标本中对 CLDN1进行免疫组化检测发现随着宫颈病变由 CIN到癌变的进展,CLDN1的表达量逐渐升高,且在有淋巴结转移的癌组织中,强阳性的比例明显高于无淋巴结转移的癌组织(P<0.05)。
　　结论:我们利用CGH芯片筛选出了宫颈癌中拷贝数改变的相关片段和基因,并对芯片结果进行了大样本的验证,筛选出了CLDN1等与宫颈癌的进展及转移有密切关系的基因。
　　第二部分
　　CLDN1正义和反义质粒表达载体的构建
　　目的:构建 pcDNA3.1-CLDN1正义表达载体和pRNAT-U6.1/Neo-shRNA-CLDN1反义表达载体,并筛选出稳定转染了各载体的细胞克隆。
　　方法:以 SIHA细胞为模板,利用PCR扩增出 CLDN1基因 mRNA的全长序列,利用HindⅢ和BamHI双酶切将序列连接到 pcDNA3.1(+)质粒载体中。化学合成针对 CLDN1的shRNA序列,利用HindⅢ和BamHI双酶切将序列连接到pRNAT-U6.1/Neo质粒载体中。将测序成功的质粒转染到 SIHA细胞中,做稳定转染的细胞克隆筛选,并对克隆进行鉴定。
　　结果:构建的pcDNA3.1-CLDN1载体和pRNAT-U6.1/Neo-shRNA-CLDN1载体经测序鉴定构建成功,筛选出的正义表达细胞克隆能成功地提高 CLDN1的表达水平,反义表达细胞克隆能成功地降低 CLDN1的表达水平。
　　结论:我们成功构建了pcDNA3.1-CLDN1载体和pRNAT-U6.1/Neo-shRNA-CLDN1载体并成功得到了稳定转染相应表达载体的细胞克隆。
　　第三部分
　　CLDN1对宫颈癌细胞系SIHA的作用及机制研究
　　目的:研究 CLDN1在 SIHA细胞中的作用及其机制。
　　方法:将针对 CLDN1的siRNA及正义反义质粒载体 pcDNA3.1-CLDN1和pRNAT-U6.1/Neo-shRNA-CLDN1分别转染到 SIHA细胞中,利用Transwell小室检测细胞的迁移和侵袭能力的变化,并检测相应的抗凋亡能力、克隆形成能力、MMPs的活性及上皮细胞间充质转化(EMT)相关蛋白指标的变化,并对 CLDN1影响 EMT的机制进行初步研究。
　　结果:CLDN1的高表达能促进 SIHA细胞的迁移能力和侵袭能力,同时高表达CLDN1的细胞抗凋亡能力增强,克隆形成能力增强,MMP-9的活性增强,并且伴随着上皮细胞相关蛋白指标(E-cadherin)的下降及间质细胞相关蛋白指标(Vimentin)的升高。干扰掉 CLDN1的表达后则表现出相反的效应。过表达 CLDN1后转录因子SNAI1和SNAI2的表达增加。
　　结论:CLDN1能促进 SIHA细胞的迁移能力和侵袭能力增强,这种能力的增强有可能是通过其促进细胞的EMT及相应的抗凋亡能力增强、克隆形成能力增强和MMP活性增强有关。CLDN1有可能是通过与 SNAI1和SNAI2的直接或间接相互作用而影响 EMT。

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中文摘要

英文摘要

前 言

参考文献

第一部分利用CGH芯片检测宫颈癌组织基因组DNA的拷贝数变化

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材料和方法

实验结果

讨 论

参考文献

第二部分CLDN1正义和反义质粒表达载体的构建

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材料和方法

实验结果

讨 论

参考文献

第三部分CLDN1对宫颈癌细胞系SIHA的作用及机制研究

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前 言

材料和方法

实验结果

讨 论

参考文献

全 文 总 结

文献综述

上皮细胞间质化转化（EMT）

EMT的分子基础

宫颈癌中EMT相关的信号通路

HPV病毒蛋白

可溶性因子和他们的受体

离子转运系统

细胞骨架调节

转录因子

Snail转录因子的调节

参 考 文 献

博士期间以第一作者发表的论文（附录）

致谢