tmTNF-α通过TNFR1介导细胞凋亡的分子机制及tmTNF-α反向信号通路的研究

摘要

跨膜型TNF-α(transmembrane tumor necrosis factor-alpha,tmTNF-α)是分泌型TNF-α(secretory TNF-α,sTNF-α)的前体,它以稳定的同源三聚体的形式表达于活化的巨噬细胞、淋巴细胞或其他类型细胞的表面。sTNF-α被TNF转化酶(TNF-α converting enzyme, TACE)从tmTNF-α上剪切释放到胞外,与其相应的受体结合并发挥生物学功能。越来越多的证据显示,不仅是sTNF-α,tmTNF-α亦可通过TNFR1和TNFR2介导多种生物学效应,包括细胞的凋亡与增殖、细胞因子的产生以及局部炎症反应的调节等。
　　tmTNF-α既可作为配体传递正向信号,也可作为受体来传递反向信号。本室前期工作证实tmTNF-α可通过TNFR1介导细胞凋亡;然而该分子如表达在肿瘤细胞则可通过反向信号激活NF-κB,导致抗凋亡。但其具体的分子机制尚不清楚。本研究主要探讨tmTNF-α作为配体通过TNFR1转导正向信号介导肿瘤细胞凋亡及其作为受体转导反向信号保护肿瘤细胞抵抗凋亡的分子机制。其主要结果如下:
　　一、tmTNF-α通过TNFR1介导细胞凋亡的分子机制
　　1.tmTNF-α不能介导TNFR1的内化:用流式与激光共聚焦显微镜证实sTNF-α导致细胞表面TNFR1表达降低,TNFR1胞浆移位明显增加,用MDC预处理则可明显抑制sTNF-α诱导的TNFR1向胞浆内的内化;而tmTNF-α则对细胞表面TNFR1的表达无明显影响,且不诱导受体向胞浆内移位。提示tmTNF-α不能诱导TNFR1内化。
　　2.tmTNF-α的胞毒效应不依赖TNFR1的内化:首先用MTT证实用MDC抑制TNFR1的内化,可明显降低sTNF-α的胞毒效应,却对tmTNF-α胞毒效应无影响。进一步用AnnexinV-PI凋亡检测试剂盒和WB证实用MDC可明显降低sTNF-α诱导的caspase-3的活化及细胞凋亡,但不影响 tmTNF-α诱导的caspase-3的活化及细胞凋亡。上述结果提示,与sTNF-α胞毒效应依赖TNFR1内化的特征相反,tmTNF-α诱导靶细胞凋亡为TNFR1内化非依赖性的。
　　3.tmTNF-α通过细胞膜上的TNFR1募集TRADD,FADD和caspase-8:分别提取细胞总蛋白,IP-western证实:tmTNF-α与sTNF-α均能通过TNFR1募集TRADD、FADD和caspase-8,形成DISC信号复合物。进一步分离胞膜蛋白和胞浆蛋白,用IP证实tmTNF-α诱导TNFR1形成的DISC信号复合物位于膜蛋白中,且可用激光共聚焦显微镜观察到tmTNF-α诱导DISC信号复合物的成员之一FADD从胞浆转位到细胞膜;而sTNF-α诱导TNFR1形成的DISC信号复合物则位于胞浆蛋白中。提示两型TNF-α尽管作用于同一受体,但二者分别在细胞不同部位诱导DISC信号复合物的形成。
　　4.tmTNF-α不能通过TNFR1在细胞膜上募集RIP-1,TRAF2和cIAP1:提细胞膜蛋白进行IP证实:sTNF-α可通过TNFR1在细胞膜上募集RIP-1,TRAF2和cIAP1等激活NF-κB的信号复合物;而tmTNF-α则无明显类似效应。提示与sTNF-α不同,tmTNF-α不能通过TNFR1在细胞膜上募集抗凋亡信号分子。
　　5.tmTNF-α不依赖于TNFR1的死亡结构域募集死亡信号分子:分别将野生型TNFR1和缺失DD的TNFR1突变体瞬时转染HEK293细胞,两型TNF刺激30分钟后提取细胞膜蛋白进行IP。结果发现tmTNF-α不但可通过野生型TNFR1,也能够通过缺失DD结构域的TNFR1募集TRADD,FADD和caspase-8等DISC信号复合物。提示与sTNF-α不同,tmTNF-α通过TNFR1募集DISC信号复合物不依赖于受体的死亡结构域。
　　6.tmTNF-α通过TNFR1非DD结构域在细胞膜上募集STAT1,形成DISC信号复合物:为探讨tmTNF-α诱导TNFR1募集DISC复合物分子的机制,用胞膜蛋白进行IP,证实:tmTNF-α可通过野生型和缺失DD的TNFR1募集STAT1,但sTNF-α则不能。提取细胞总蛋白进行IP,进一步证实sTNF-α诱导TNFR1形成的DISC复合物中有大量STAT1参与,但TNFR1缺失DD则不能被诱导形成DISC复合物,且无STAT1共沉淀,提示STAT1参与sTNF-α诱导的DISC信号复合物,且依赖TNFR1的DD结构域;然而,tmTNF-α通过野生型和缺失DD的TNFR1形成的DISC复合物中均有明显STAT1的共沉淀,提示STAT1可能通过与TNFR1非DD结构域直接结合,参与tmTNF-α通过TNFR1募集DISC信号复合物。
　　二、tmTNF-α反向信号通路的研究
　　1.NIK、SODD参与tmTNF-α反向信号复合物:用tmTNF-α单抗对高表达tmTNF-α的Raji细胞进行IP,证实tmTNF-α可与NIK、SODD发生免疫共沉淀。反之,用NIK或SODD的特异性抗体分别进行反向IP,证实均有tmTNF-α共沉淀。提示除了前期工作发现的TRAF1,IKKα和NF-κBp52以外,NIK和SODD也是tmTNF-α反向信号复合物中的成员。
　　2.tmTNF-α通过胞浆段(TNF-LS)募集TRAF1:将TRAF1,IKKα和tmTNF-α野生型或突变体质粒共转染于293T细胞中,提取总蛋白,用tmTNF-α单抗进行IP。证实:野生型tmTNF-α和缺失胞外段的TNF-LS均可募集TRAF1,而缺失胞浆段的ΔCS-tmTNF-α则不能募集TRAF1。提示tmTNF-α通过其胞浆段募集TRAF1。
　　3.tmTNF-α胞浆段(TNF-LS)不能直接与IKKα结合:本研究为了验证细胞内TNF-LS和IKKα的相互作用,将二者共转到293T细胞中,IP-Western显示TNF-LS并未与IKKα共沉淀。提示TNF-LS不能直接结合IKKα,可能通过TRAF1间接募集该分子。
　　4.TRAF1是连接tmTNF-α与IKKα的接头分子:使用siTRAF1下调 Raji细胞表达TRAF1,导致与tmTNF-α免疫共沉淀的IKKα明显减少。提示TRAF1作为衔接分子可将IKKα募集到tmTNF-α反向信号复合物中。
　　5.抑制tmTNF-α磷酸化可促进其反向信号复合物TRAF1/IKKα/NF-κBp52的形成:tmTNF-α胞浆段含有CKI磷酸化酶的作用位点,故我们用CKI的特异性抑制剂D4476抑制tmTNF-α的磷酸化,结果发现tmTNF-α反向信号复合物(TRAF1/IKKα/NF-κBp52)形成明显增加。提示抑制tmTNF-α的磷酸化能促进其反向信号复合物的形成。
　　综上所述,本课题阐明了tmTNF-α通过TNFR1介导正向信号导致靶细胞凋亡的信号通路,证实tmTNF-α可能直接通过细胞膜上TNFR1的非DD结构域与STAT1结合,进而募集TRADD、FADD和caspase-8,形成DISC信号复合物,导致caspases的级联活化,进而诱导细胞凋亡。同时在前期工作的基础上,进一步阐明了tmTNF-α反向信号复合物的组成及其成员之间的相互关系,tmTNF-α一方面通过其胞浆段募集TRAF1、NIK和IKKα,进而激活NF-κBp52(非经典途径),另一方面可能通过其胞浆段与TNFR1竞争SODD,参与激活NF-κB经典途径,导致tmTNF-α(+)的肿瘤细胞抵抗凋亡。
　　本研究深入探讨了tmTNF-α通过TNFR1介导正向信号诱导靶细胞凋亡以及通过反向信号促进tmTNF-α(+)的肿瘤细胞抵抗凋亡的分子机制,为临床肿瘤治疗及干预肿瘤耐药提供新的思路和靶点。

目录

封面

声明

目录

英文缩略词表

中文摘要

英文摘要

第一部分 tmTNF-α通过TNFR1介导细胞凋亡的分子机制

前 言

材料和方法

实验结果

讨 论

小 结

第二部分 tmTNF-α反向信号通路的研究

前 言

材料与方法

实验结果

小 结

全文小结

本研究主要创新点

参考文献

综 述

一、STAT1蛋白的结构

二、STAT1依赖的IFN信号通路

三、STAT1信号通路的调节

四、 STAT1与肿瘤

五、STAT1调节细胞死亡

六、STAT1调节细胞死亡的机制

七、STAT1作为治疗靶点的潜能

八、总结

参考文献

附录 已发表文章及待发表文章

致谢