弥漫性轴索损伤后大鼠脑脊液中β-APP、NF-L及NGB早期变化的初步研究

摘要

背景：弥漫性轴索损伤（diffuse axonal injury，DAI）是剪切旋转等机械性暴力作用于脑部后造成的以大脑白质广泛性轴索损伤为特征的一种较为特殊的颅脑损伤。其可分为原发性损伤（机械性暴力直接导致的轴索损伤）及继发性损伤。继发性轴索损伤是DAI最重要的环节，是在原发性轴索损伤的基础上而形成的继发性的轴索损伤。原发性轴索损伤可以引起各种继发性病变，这些损伤及病变经过一系列的生理生化改变后会造成轴索损伤，形成轴索肿胀、坏死甚至断裂。继发性轴索损伤与Ca2+超载、轴浆运输障碍、线粒体损伤、轴索细胞骨架破坏、氧自由基形成、炎症因子损伤等因素密切相关。而在这诸多因素中，Ca2+超载发挥着核心作用。DAI基本病变包括脱髓鞘改变，轴索肿胀、扭曲，轴索骨架崩解，神经微丝致密化(neurofilament compaction,NFC)以及收缩球(retraction balls，RBs)形成等。自1956年DAI的病理学改变第一次被发现以来，随着科学技术的不断进步和DAI研究的不断深入，DAI的诊断技术和诊断方法也不断增多。目前法医学上多采用免疫组织化学检测技术等组织病理学技术对DAI进行疾病诊断和病情评估，但该方法常受损伤时间、组织自溶及病理诊断水平等因素影响，在应用和推广上具有很大的局限性。在临床医学上，影像学技术是DAI诊断和评估的重要途径。早期的影像学方法对于诊断DAI十分困难，不过随着弥散张量成像（DTI）在DAI诊断上的运用很大程度上提高了DAI的诊出率和准确率，不过相应技术仍然不够成熟。为了进一步完善DAI诊断体系、寻找新的诊断方法，探索血清或脑脊液（cerebrospinal fluid，CSF）中DAI特异性生化指标并研究其浓度与时间的关系成为近年来探寻诊断DAI方法中的研究热点。
　　在DAI继发性损伤中，轴索损伤及崩解后，会产生血影蛋白裂解产物（spectrin breakdown products，SBDPs）、神经微丝碎片（Neurofilaments，NFs)、微管蛋白降解产物等，这些降解产物可随后进入CSF中。此外，DAI在造成人体损伤的同时也会激活机体的保护机制，释放各种保护性细胞因子并进入CSF中，这些因子对于DAI诊断也具有重要作用。所以，利用CSF分子标志物来诊断DAI具有良好的可行性和广阔的研究前景。目前CSF中被发现和研究的DAI标记物不仅种类较少，而且大多的研究还停留在初级阶段，在诊断DAI上也具有很大的局限性。故而进一步探寻新的生化标记物以及进一步深化研究 DAI损伤后这些生化标志物浓度与时间变化规律对于临床及法医学研究都具有十分重大的意义。有研究表明颅脑损伤后β-APP、NF-L及NGB三种标志物在DAI后会发生特异性改变。β-APP是广泛存在神经元细胞膜上的跨膜蛋白，并被成熟的运用于DAI免疫组织化学诊断技术上，DAI后CSF中的水平增高。神经微丝蛋白（neurofliament，NF）是细胞骨架的重要组成部分，DAI后会发生降解生成NF-L，NF-M以及NF-H。NF-L是最先发生降解的产物，其敏感性和特异性位于三种产物首位，其在脑组织及血液中的研究均较为成熟。脑红蛋白（Neuroglobin，NGB），是珠蛋白家族中的新成员之一，其对神经系统具有保护作用。研究证实 NGB含量与脑外伤后继发的缺血缺氧、脑水肿在时间窗、区域和损伤程度上都一定的相关性和一致性。此外，大鼠弥漫性轴索损伤后脑NGB mRNA的表达具有一定的相关性。表明对DAI后CSF中β-APP、NF-L及NGB进行检测可能会对DAI诊断、损伤评估及预后起到重要作用。
　　目的：研究大鼠DAI后CSF中β-APP、NF-L及NGB在不同时间点的表达水平及变化规律，初步探讨β-APP、NF-L及NGB作为DAI CSF中的分子标记物的可行性。
　　材料与方法：70只雄性SPF级大鼠随机分为7组：对照组，DAI损伤后3h、6h、12h、24h、48h、72h组。复制DAI模型后抽取CSF，并用ELISA法检测β-APP、NL-L及NGB的浓度。经统计学分析比较各组在不同时间点浓度的变化及差异。
　　结果：DAI损伤后CSF中β-APP呈先上升、下降再上升的趋势，NF-L及NGB呈先轻微下降、上升、下降再上升的趋势；与对照组相比较，β-APP在6h、12h、24h、72h改变均具有统计学差异。NF-L在12h及72h改变具有统计学差异，NGB在24h及72h改变具有统计学差异。
　　结论：脑脊液中β-APP、NF-L及NGB表达水平的时序性均与大鼠大脑DAI后继发性损伤的过程具有一定程度的吻合，部分时间点的表达水平变化在具有统计学差异，对于早期诊断DAI具有一定的意义。

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绪论

参考文献

材料与方法

1. 材料

1.1 实验动物

1.2主要仪器及试剂

2 实验方法

2.1 动物模型制作

2.2 动物分组

2.3 检材提取

2.4 ELISA法测量脑脊液中β-APP、NF-L、NGB浓度

2.5 SABC法免疫组织化学染色

实验结果

1．大鼠动物行为学、生命体征及恢复情况

2. β-APP免疫组化检测结果

3. Elisa实验结果

讨论

1. 动物行为学、生命体征、恢复情况及β-APP免疫组织化学检测结果分析

2.DAI后CSF中β-APP浓度变化结果分析

32.DAI损伤后脑脊液中NF-L浓度变化及意义

4.DAI损伤后脑脊液中NGB浓度变化及意义

结论

参考文献

综述: 弥漫性轴索损伤诊断方法研究进展

附录攻读学位期间发表论文目录

致谢