含Fz-CRD结构域的蛋白家族及两类bHLH转录因子家族的系统进化分析

摘要

G蛋白偶联受体GPCR是一类与GTP结合蛋白相偶联的含7次跨膜螺旋的受体超家族，其亚家族Frizzled（FZD）作为Wnt的受体，在胚胎发育、细胞增殖、分化和迁移等方面发挥重要作用。FZD蛋白的N端包含细胞外的半胱氨酸富集区结构域（CRD），其由10个半胱氨酸组成5对二硫桥，可以和配体Wnt结合从而激活并介导下游信号通路，该结构域称之为Frizzled-like CRD，简称Fz-CRD。bHLH（碱性-螺旋-环-螺旋，basic helix-loop-helix）转录因子超家族广泛存在于动物、植物和真菌中，参与神经发育、肌肉生成、细胞增殖、组织分化和其他一些重要的生物学过程。HES/HEY蛋白为bHLH超家族的一个家族，其结构特点为同时含有一个bHLH DNA结合结构域和Orange结构域。PAS也是bHLH的一个家族，其结构特点是含有bHLH结构域和PAS结构域，且包括两个PAS结构域。
　　本论文系统研究了含有Fz-CRD结构域的蛋白家族、bHLH转录因子超家族中两类家族（HES/HEY和PAS）的起源和进化。故本文内容主要分为三个部分。
　　第一，本文研究了含有Fz-CRD结构域的蛋白家族的起源进化。同源搜索发现Fz-CRD结构域存在于多类蛋白质中，包括FZD、SFRP、RTK、MFRP、CPZ、CORIN和COL18A1等。Fz-CRD结构域在盘基网柄菌（Dictyostelium discoideum）这一低等真核生物中已经存在，且与Frizzled的七次跨膜结构域融合形成Frizzled受体。此后，FZD受体在不同物种中经过复制、分化和内含子丢失等过程，最终在脊椎动物中形成11个成员。此外，通过分析SFRP和具有Fz-CRD的RTK发现它们在海绵动物中存在，在脊椎动物中有较明显的扩增。MFRP、CPZ、CORIN和COL18A1等几类含Fz-CRD的蛋白是在脊椎动物进化中通过结构域融合而出现。另外，我们还发了Fz-CRD上的一个糖基化位点可能与Wnt配体结合有关。基于这些结果，我们提出了一个含Fz-CRD结构域的蛋白融合和进化模型，并推测其在后生生物和脊椎动物中发生了两轮基因扩增。
　　第二，本文研究了HES/HEY转录因子家族的起源和进化。HES/HEY家族是bHLH转录因子超家族的一员。HES/HEY蛋白是Notch信号的直接目标基因，在神经系统、体节发生、血管发育和心脏发育中发挥重要作用。我们系统鉴定了10多个代表性物种中的HES/HEY家族基因，对其进行起源和进化分析。结果显示HES/HEY基因只存在于后生生物中，可能起源于后生生物的共同祖先。本研究选取bHLH和Orange两个结构域，用不同方法构建进化树（Bayes、ML、NJ和ME），把HES/HEY基因分为四类，并推测了HES/HEY基因家族经历了三次扩增，分别与真后生生物、脊椎动物和硬骨鱼的起源相联系。基因结构分析发现不同物种中HES/HEY涉及外显子或者内含子的丢失。我们提出了HES/HEY基因家族进化模型，阐述HES/HEY基因的扩增、外显子/内含子丢失和motif丢失等进化历程。此外，还研究了硬骨鱼特异性复制，并用RT-PCR检测了斑马鱼不同组织中复制基因的不同表达模式。本研究将对Notch信号在发育中的功能研究提供一定的指导作用。
　　第三，本文研究了bHLH/PAS转录因子家族的进化。bHLH/PAS家族参与环境的转录应答和神经发育等过程，其系统进化研究较少。我们在不同的代表性物种中鉴定了bHLH/PAS基因，用不同的方法（Bayes、ML、NJ和ME）构建了系统进化树，结果表明bHLH/PAS可以较为明显的分成几个类，每个类在进化树中都有很高的支持率。外显子和内含子结构分析表明，一个保守的相位为“1001-0210”的八外显子结构存在于海葵、海胆和文昌鱼等原始生物的bHLH/PAS基因中，进化过程中该八外显子结构的保留或丢失，形成了现在哺乳动物中的bHLH/PAS成员。通过对全长序列的功能歧化研究，发现大部分的bHLH/PAS成员之间的功能歧化系数都大于0，暗示其进化过程发生了选择性限制改变。没有发现正选择位点，暗示净化选择（负选择）在这三个结构域的进化过程中起重要作用。这些结果有助于探究bHLH/PAS的起源和进化。

目录

封面

声明

中文摘要

英文摘要

目录

1 绪论

1.1 GPCR和Wnt信号通路

1.2 bHLH转录因子超家族

1.3 进化生物学

1.4 主要研究方法

2 进化分析揭示了Frizzle-like CRD的结构域融合

2.1 研究背景

2.2 材料与方法

2.3 结果和分析

2.4讨论

3 HES/HEY转录因子家族的进化分析

3.1 研究背景

3.2 材料与方法

3.3 结果和分析

3.4 讨论

4 PAS转录因子家族的进化和功能歧化分析

4.1 研究背景

4.2 材料与方法

4.3 结果和分析

4.4 讨论

5 总结

5.1 主要的研究成果

5.2 本研究的创新之处

5.3 展望

致谢

参考文献