C型利钠肽(CNP)对人精子功能及小鼠体外受精的影响研究

摘要

第一部分：CNP及其受体NPR-B在人精子上的表达定位
　　目的：检测CNP及其特异性受体NPR-B在人精子上的免疫定位,初步探讨其与精子功能的相关性。
　　方法：利用间接免疫荧光技术,激光共聚焦下观察CNP及NPR-B在人精子上的表达定位。
　　结果：NPR-B主要表达于人精子头部的顶体区及尾部前段胞膜上,CNP则未见表达。
　　结论：CNP的受体NPR-B特异表达于人精子头部的顶体区及尾部前段胞膜上,提示CNP可能对精子运动能力、顶体反应及受精能力有一定的影响。
　　第二部分：CNP对人精子活力、活率、顶体反应的影响
　　目的：观察CNP对体外培养的人精子活力、活率及顶体反应的影响
　　方法：从湖北省人类精子库收集初筛常规分析正常的精液标本,将精子分离体外培养,每一份标本根据精子体外培养液中CNP的浓度不同分为三组,阴性对照组,CNP10-7mol/L组,CNP10-6mol/L组,在加入CNP后5min、30min、60min、120min、240min分别检测各组精子的活力、活率,每次检测需重复计数3次取均值,活率计数用伊红Y染色法。分别于加入CNP后0h、3h、6h用考马斯亮蓝R250染色法观察CNP对精子顶体反应的影响,每次检测需重复计数3次取均值。
　　结果：1、在相同时间点将CNP处理组和对照组的精子活力、活率进行比较,发现处理组精子活力、活率在30min时比对照组的精子活力、活率高,并且呈现剂量依赖性,CNP10-6mol/L组的刺激作用更加显著,经方差分析,与对照组相比,CNP10-7mol/L组的差异有显著性意义(P<0.05),CNP10-6mol/L组的差异有明显统计学意义(P<0.01),其它时间点无明显差异。2、不同浓度CNP与精子共培养6h后,与对照组相比精子顶体反应率明显升高,并且也呈剂量依赖性,CNP10-6mol/L组的作用更加显著,经方差分析,其中CNP10-7mol/L组与对照组比较差异有显著性意义(P<0.05),而CNP10-6mol/L与对照组比较差异更具显著意义(P<0.01)。
　　结论：CNP能够增强体外培养精子的活力、活率,增加体外培养精子自发顶体反应,这些很可能在精子获能、受精中起着重要作用。
　　第三部分：CNP对小鼠体外受精及早期胚胎发育的影响
　　目的：观察CNP对小鼠体外受精和早期胚胎发育的影响,初步探讨CNP对小鼠体外受精率的影响及小鼠早期胚胎发育的作用,并探究其剂量效应关系。
　　方法：根据体外受精及胚胎培养液中CNP的浓度不同将实验设为三个组别:阴性对照组;CNP10-7mol/L组;CNP10-6mol/L组。取昆明雌鼠18只及雄鼠6只,对雌鼠行促排卵及促卵成熟,收集成熟卵母细胞随机平均放入体外受精培养液中,对雄性小鼠附睾尾取精,加入培养液中,使其受精,放入37℃,5％CO2培养箱中培养。培养4-6h将卵母细胞取出,置入新培养液中培养。观察指标:体外受精24h观察2-细胞形成情况,以2-细胞的形成率代表其受精率,此后根据小鼠体内受精卵的发育与运行规律,96h后统计囊胚形成率。
　　结果：阴性对照组2-细胞形成率为62.7%;CNP10-7mol/L组为66%;CNP10-6mol/L组为73.8%,CNP处理组均高于对照组,但经χ2检验仅CNP10-6mol/L组与对照组的差异具有统计学意义(P<0.05);阴性对照组囊胚形成率为30.4%,CNP10-7mol/L组为45.7%;CNP10-6mol/L组为35.5%,CNP10-6mol/L组的囊胚形成率略高于对照组,经χ2检验差异没有统计学意义,而CNP10-7mol/L组则显著高于对照组,差异有统计学意义(P<0.01)。
　　结论：CNP能够提高小鼠体外受精率,并且增加小鼠体外受精囊胚形成率。其可能原因是:首先CNP可能通过增强体外培养精子的活力、活率及增加精子顶体反应,从而使受精率增加;其次CNP在10-7mol/L的浓度下能明显增加小鼠体外受精囊胚形成率,提示CNP可能是早期胚胎发育的一个重要因子,而10-7mol/L则是早期胚胎发育的一个敏感浓度。

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前言

中文摘要

英文摘要

第一部分 CNP及其受体NPR-B在人精子上的表达定位

材料和方法

一、 实验对象

二、 主要试剂及配置

三、 主要仪器和设备

四、 实验方法

结果

讨论

参考文献

第二部分 CNP对人精子活力、活率、顶体反应的影响

材料和方法

一、实验对象

二、 主要试剂

三、 主要仪器和设备

四、 实验方法

结果

讨论

参考文献

第三部分 CNP对小鼠体外受精及早期胚胎发育的影响

材料和方法

一、 实验对象

二、 主要试剂

三、 主要仪器和设备

四、实验方法

结果

讨论

参考文献

实验小结

C型利钠肽（CNP）在生殖调控过程中作用机制的研究进展

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