β-淀粉样蛋白单体和寡聚体在星形胶质细胞中的内吞、转运及降解机制的探索与比较

摘要

阿尔茨海默症(AD)是一种常见的具有高发病率、高患病率及高致残率的神经退行性疾病。许多研究证明β-淀粉样蛋白寡聚体(oAβ)具有极大的细胞毒性,能够促使神经元死亡,导致AD发生。星形胶质细胞倾向于清除oAβ,但是机制仍不清楚。因此,本文以星形胶质细胞瘤U87细胞系为实验对象,通过体外制备oAβ42并采用硫磺素T(ThT)染色和透射电镜对其表征,利用激光共聚焦荧光显微技术,研究β-淀粉样蛋白单体(sAβ)和寡聚体在星形胶质细胞上的内吞、转运及降解机制的差异。胞吞实验结果表明,sAβ42和oAβ42均能通过巨胞饮途径进入星形胶质细胞,而且胆固醇在它们的内吞中发挥重要作用,但是统计数据表明二者对同一种胞吞途径的依赖程度不同。同时,经典的网格蛋白介导的胞吞途径并不参与这两种形态多肽的内吞过程,但是dynamin2的剪切作用却是此过程必不可少的。此外,利用RNA干扰技术沉默脂蛋白受体相关蛋白1(lipoproteinreceptor-relatedprotein1,LRP1)则抑制了sAβ42的内吞过程,但oAβ42的内吞不受影响。以上结论表明星形胶质细胞内吞sAβ42和oAβ42的机制存在差异,而且数据分析显示其更倾向于吸收oAβ42。共定位实验结果表明sAβ42和oAβ42在胞内转运的早期会进入早期内涵体,但最终则在溶酶体中积累。通过细胞活力测定实验(MTS)和体外降解实验进一步证实星形胶质细胞具备降解sAβ42和oAβ42的能力,及时避免了oAβ42的细胞毒性,然而,与sAβ42相比,oAβ42却更难以被星形胶质细胞降解。因此,我们的研究是首次探究并比较了sAβ42和oAβ42在星形胶质细胞上的内吞、转运及降解机制的差异,为AD的预防和治疗提供新的靶点。

目录

封面

声明

中文摘要

英文摘要

目录

1 绪 论

1.1 阿尔茨海默症简介

1.1.1 阿尔茨海默症的临床表现及病理改变

1.1.2 阿尔茨海默症的发病机制

1.2β-淀粉样蛋白的代谢过程

1.2.1 Aβ的产生

1.2.2 胞内Aβ的来源

1.2.4 胞内Aβ的转运与降解

1.3 本文研究的出发点和主要内容

2材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 主要实验试剂

2.1.2 常用质粒

2.2 实验方法

2.2.1 Aβ42聚集体的制备实验原理：

2.2.2 硫磺素T （ThT）染色染色原理：

2.2.3 RNA干扰技术和基因定点突变

2.2.4 细胞培养与转染技术

2.2.5 荧光标记的Aβ42内吞及降解实验

2.2.6 荧光标记Aβ42胞内转运实验

2.2.7 细胞活力测定

2.3 主要实验仪器

2.3.1 透射电镜 （TEM）

2.3.2 激光共聚焦荧光显微镜（confocal）

2.4 数据统计及分析

3 实验结果

3.1 sAβ42和oAβ42的制备与表征

3.2 星形胶质细胞内吞sAβ42实验条件的优化

3.3 sAβ42和 oAβ42均能通过巨胞饮途径进入星形胶质细胞并且胞吞过程需要胆固醇

3.4 星形胶质细胞不以网格蛋白介导的途径吸收sAβ42和oAβ42，但是内吞sAβ42则依赖LRP1

3.5 dynamin 2在sAβ42和oAβ42的内吞中必不可少

3.6 内吞后的sAβ42和oAβ42被快速转运至溶酶体

3.7 星形胶质细胞对内吞后的sAβ42和oAβ42进行有效降解

4 讨 论

致谢

参考文献

附 录