Notch-1基因敲除兔骨髓间充质干细胞阻止兔椎间盘退行性变的实验研究

摘要

目的：研究小分子干扰RNA(siRNA)靶向沉默兔骨髓间充质干细胞(MSC)中Notch-1基因,并通过TGF-β1诱导Notch-1基因沉默MSC向髓核样细胞定向分化,观测Notch-1基因在MSC向类软骨细胞定向分化时的调节作用。
　　方法：(1)4-6周龄新西兰兔麻醉后,取股骨骨髓,以密度梯度离心法分离培养MSC;(2)根据siRNA原理针对Notch-1设计短发卡状RNA(shRNA),瞬时转染入MSC,转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导转染MSC分化;(3)实验分组为TGF-β1诱导无转染组MSC、TGF-β1诱导转染无意siRNA空质粒组MSC、TGF-β1诱导转染siRNA-Notch-1质粒组MSC三组,甲苯胺蓝染色及Ⅱ型胶原染色检测MSC的细胞表型的改变情况;(4)RT-PCR及Westernblot法检测三组细胞中Ⅱ型胶原(COL2)及蛋白聚糖(ACAN)基因表达水平。
　　结果：(1)光镜下观察MSC细胞形态主要为梭形或椭圆形,呈巢状或漩涡状生长;(2)转染后MSC中Notch-1基因沉默效率为47％(P<0.001),即所选位点具有明显的沉默效果。(3)甲苯胺蓝染色TGF-β1诱导转染siRNA-Notch-1质粒组MSC染色阳性表达明显高于其余两组。(4)RT-PCR检测发现TGF-β1诱导转染siRNA-Notch-1质粒组MSC的COL2表达为TGF-β1诱导无转染组MSC的2.55倍(P<0.001),为TGF-β1诱导转染无意siRNA空质粒组MSC的2.53倍(P<0.001)。ACAN表达分别为1.51倍(P<0.01)和1.53倍(P<0.01)。Westernblot检测发现TGF-β1诱导转染siRNA-Notch-1质粒组MSC的COL2表达为TGF-β1诱导无转染组MSC的1.25倍(P<0.05),为TGF-β1诱导转染无意siRNA空质粒组MSC的1.37倍(P<0.05)。ACAN表达分别为1.99倍(P<0.05)和1.46倍(P<0.05)。
　　结论：(1)使用密度梯度离心法可以分离出纯度较高的MSC。(2)三组细胞经TGF-β1诱导均可产生COL2及ACAN,表现出类软骨细胞表型;TGF-β1诱导转染siRNA-Notch-1质粒MSC表型基因表达较转染空质粒MSC及未转染MSC显著提高。
　　目的：使用纤维环穿刺抽吸法造模兔椎间盘退行性变,移植转化生长因子β1(TGF-β1)诱导Notch-1基因沉默兔骨髓间充质干细胞(MSCs)到退变的椎间盘内,观测退变椎间盘的变化。
　　方法：(1)4只体重0.4-0.5kg新西兰兔麻醉后,取股骨骨髓,以密度梯度离心法分离培养MSCs;(2)将针对Notch-1的短发卡状RNA(shRNA)及无意空质粒shRNA,瞬时转染入MSCs,TGF-β1诱导转染MSCs分化;(3)体重1.0-1.5kg新西兰兔10只,手术对兔脊柱L3-4、L4-5、L5-6三个椎间盘行穿刺抽吸髓核组织造模,2周后行核磁共振成像(MRI)检查观测造模情况;将细胞分为TGF-β1诱导转染空质粒组、TGF-β1诱导转染shRNA-Notch-1质粒组、TGF-β1诱导无转染组三组细胞,造模2周后分别移植入L3-4、L4-5、L5-6三个椎间盘,4周后行MRI检查观测细胞治疗情况;(4)动物MRI检查后处死行髓核组织的甲苯胺蓝染色观测蛋白多糖表达情况,RT-PCR及Western-blot检测退变椎间盘组织Ⅱ型胶原(COL2)及蛋白多糖(ACAN)改变情况。
　　结果：(1)细胞移植4周后MRI检测发现,L4-5椎间盘%T2加权像扫描(%ST2WI)值增加最为明显,与其他2组有明显差异;L3-4、L5-6椎间盘%ST2WI值增加,两组间无统计学差异。(2)甲苯胺蓝染色:与空白对照组及阴性对照组相比较,实验组椎间盘组织内蛋白多糖的表达显著提高。(3)RT-PCR检测发现实验组椎间盘内Ⅱ型胶原及蛋白多糖的表达明显高于其余两组,存在显著性差异,阴性对照组与空白对照组间无显著性差异(4)Westernblot检测发现实验组椎间盘内Ⅱ型胶原及蛋白多糖的表达明显高于其余两组,存在显著性差异,阴性对照组与空白对照组间无显著性差异。
　　结论：兔退变椎间盘内移植Notch-1基因敲除兔骨髓间充质干细胞,可有效的修复退变椎间盘组织。

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前言

第一部分 沉默Notch-1基因的兔骨髓间充质干细胞在TGF-β1诱导下向类软骨细胞转化的实验研究

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材料

方法

讨论

参考文献

附图表

第二部分 Notch-1基因敲除兔骨髓间充质干细胞阻止兔椎间盘退行性变的实验研究

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英文摘要

材料

方法

讨论

参考文献

附图表

综述

致谢