TLR4及其相关信号通路在自身免疫性糖尿病中的作用机制探讨与药物干预

摘要

第一部分：TLR4信号通路对NOD小鼠自身免疫性糖尿病发病的影响
　　实验背景：
　　目前临床上尚无自身免疫性糖尿病(Autoimmune diabetes),又称1型糖尿病(Type 1 diabetes mellitus,T1DM)的有效治疗手段。传统观点认为,感染是T1DM发病的诱因之一。但近年来,基于卫生假说的提出,动物和临床研究均显示,适当的感染对包括T1DM在内的自身免疫性疾病发病具有抑制作用,其具体机制尚不清楚。而作为来源于革兰氏阴性菌脂多糖(Lipopolysaccharid,LPS)的受体,Toll-like receptor(TLR)4在T1DM中的作用引起了人们的关注。我们设想,LPS对TLR4信号通路的调节作用可能参与其对T1DM发病的干预。
　　目的：
　　研究LPS干预对非肥胖糖尿病(non-obese diabetic,NOD)鼠自发性自身免疫性糖尿病发展的影响及其可能机制,重点观察TLR4表达的变化,探讨TLR4在LPS对T1DM干预效应中的作用。
　　方法：
　　7-8周龄雌性NOD小鼠随机分为3组:对照组、LPS单次干预组、LPS多次干预组,每组20只。LPS单次干预组于NOD小鼠7-8周龄腹腔注射LPS10μg/只,之后每周腹腔注射生理盐水0.2ml/只,连续3周;LPS多次干预组于7-8周龄开始,每周每只NOD小鼠腹腔注射10μgLPS,连续4周;对照组于7-8周龄开始,每周腹腔注射生理盐水0.2ml/只,连续4周。于最后一次干预后,每组随机选取8只11-12周龄NOD小鼠行腹腔内葡萄糖耐量试验、取血清测定细胞因子水平、处死后取胰腺、胸腺及脾脏,行胰腺病理组织学检查、分离脾脏淋巴细胞,测定T淋巴细胞增殖反应及CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞(Regulatory T cells,Treg)比例、分离骨髓来源的树突状细胞(dendritic cells,DC)并测定其表型、同时测定胰腺、胸腺、脾脏组织及DCTLR4表达。每组剩余动物继续饲养至26-27周龄,每周2次尾静脉取血,测定血糖了解糖尿病发病情况。
　　结果：
　　LPS多次干预能够改善11-12周龄NOD鼠糖耐量并显著降低糖尿病发病率;LPS单次干预组仅能改善糖耐量。LPS干预不保护或逆转NOD小鼠胰岛炎,也不影响胰岛数目,对Th2型细胞因子水平、DC表型以及脾脏TLR4表达均无显著影响,但能抑制Th1型细胞因子生成及脾淋巴细胞增殖反应、促进CD4+CD25+Foxp3+Treg分化、并显著下调胸腺、DC以及胰腺TLR4表达。
　　结论：
　　LPS干预(特别是多次干预)通过延缓胰岛炎向糖尿病发病的恶化过程发挥T1DM保护作用。其保护机制可能与两种重要的免疫耐受相关细胞Treg和DC有关-一方面LPS促进Treg分化,促进免疫耐受的形成;另一方面通过下调DCTLR4表达,控制LPS信号通路的活化,而对抗DC的致免疫作用。
　　第二部分：红活麻总香豆素通过下调TLR4信号通路发挥自身免疫性糖尿病保护作用
　　实验背景：
　　民族药红活麻(Urtica dentata Hand,UDH)为荨麻科艾麻属植物珠芽艾麻(Laportea bulbifera(Sieb.et.Zucc.)Wedd)的干燥根,因具有抗炎和免疫调节作用,在以类风湿关节炎为代表的自身免疫性疾病治疗方面的应用由来已久,其主要活性成分为香豆素类。
　　目的：
　　研究红活麻总香豆素(Total coumarins,TC)对自身免疫性糖尿病发病的影响。
　　方法：
　　8周龄雌性NOD小鼠随机分为4组:对照组、TC低、中、高剂量组。给药低、中、高剂量组分别以37.5、75和150mg/kgTC隔日灌胃给药,对照组同法给予等容积生理盐水,连续4周,每组20只。于最后一次给药后,每组随机选取8只12周龄NOD小鼠行腹腔内葡萄糖耐量试验,取血清测定细胞因子水平,处死后取胰腺、胸腺及脾脏,行胰腺病理组织学检查、分离脾脏淋巴细胞,测定T淋巴细胞增殖反应及CD4+CD25+Foxp3+Treg比例、分离骨髓来源DC并测定其表型、测定胸腺、脾脏组织Foxp3表达、胰腺、胸腺、脾脏组织及DCTLR4表达、并检测TLR4相关信号分子mRNA表达。每组剩余动物继续饲养至26周龄,每周2次尾静脉取血,测定血糖了解糖尿病发病情况。
　　结果：
　　与对照组相比,TC连续给药4周能够改善NOD鼠胰岛炎症、提高糖耐量并显著降低糖尿病发病率。TC可抑制脾T淋巴细胞增殖反应、诱导Th2偏向性细胞因子反应、促进CD4+CD25+Foxp3+Treg分化和Foxp3mRNA表达。TC给药组DC表型呈现MHC-II和CD86分子低表达状态。此外,TC给药组胰腺、胸腺、脾脏组织及DCTLR4表达显著下调。TLR4下游关键分子髓样分化因子(myeloid differentiation factor,MyD)88、核因子(nuclear factor,NF)-κB,IL-1β,干扰素β诱导性toll–IL-1受体相关衔接蛋白(Toll–IL-1 receptor domain-containing adaptor inducing interferon-β,TRIF),TRIF相关衔接分子(TRIF-related adaptor molecule,TRAM),干扰素调节因子(interferon regulatory factor,IRF)-3及IFN-β在TC给药组均显著下调,提示TC对TLR4下游MyD88依赖性和非依赖性信号通路均有抑制作用。
　　结论：
　　TC通过下调TLR4信号通路发挥自身免疫性糖尿病保护作用。
　　第三部分：Kv1.3相关DCTLR4信号通路的体外研究与药物干预
　　实验背景：
　　DC表面TLR4在调控DC致免疫和致耐受作用中的作用至关重要。而Shaker相关电压门控Kv1.3(KCNA3)在DC功能调控方面也具有重要作用。公认的TLR4配体LPS刺激DC成熟的过程中伴有Kv1.3的上调,而Kv1.3抑制剂能够抵消LPS的刺激作用。
　　目的：
　　利用小鼠DC2.4细胞系,体外研究TLR4与Kv1.3的相互作用,并在此基础上研究红活麻总香豆素对DCTLR4/Kv1.3信号通路的影响。
　　方法：
　　对数生长期DC2.4细胞分为4组:LPS处理组、LPS+TC处理组、LPS+Kv1.3抑制剂处理组及空白组,FACS法测定各组DC上MHC-II表达,Western blot法测定DCTLR4及Kv1.3表达水平的改变。
　　结果：
　　DC2.4细胞结构性表达TLR4及Kv1.3,而LPS能够显著诱导二者在DC上的表达。Kv1.3抑制剂能够显著抑制Kv1.3的蛋白表达,并显著对抗TLR4配体LPS诱导的DC上MHC-II的上调,但对LPS诱导的DCTLR4表达水平并无显著影响。体外给予50μg/ml红活麻总香豆素能够显著抑制LPS诱导的DC上MHC-II、TLR4及Kv1.3表达。
　　结论：
　　Kv1.3与DCTLR4信号通路相关;Kv1.3也参与红活麻总香豆素对DCTLR4信号通路的干预过程。

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主 要 缩 略 词

中文摘要

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第一部分TLR4信号通路对NOD小鼠自身免疫性糖尿病发病的影响

前言

材料与方法

结果

讨论

小结

参考文献

第二部分红活麻总香豆素通过下调TLR4信号通路发挥自身免疫性糖尿病保护作用

前言

材料与方法

结果

讨论

小结

参考文献

第三部分Kv1.3相关DC TLR4信号通路的体外研究与药物干预

前言

材料与方法

结果

讨论

小结

参考文献

结论

综述

致谢

攻读博士学位期间撰写和发表的论文