ROS依赖的内质网应激-自噬反应在醉茄素A诱导人胰腺癌细胞凋亡中的作用研究

摘要

第一部分醉茄素A通过氧化应激损伤诱导人胰腺癌细胞凋亡
　　目的:研究醉茄的活性成分醉茄素A(withaferinA,WA)对人胰腺癌细胞增殖、凋亡等的影响及其可能的作用机制。
　　方法:采用CCK-8法检测细胞增殖活性;倒置显微镜观察WA对细胞形态的影响;Hoechst33258荧光染色和AnnexinV–FITC/PI双标流式细胞术检测细胞凋亡;JC-1荧光探针检测细胞线粒体膜电位;PI染色流式细胞术检测细胞周期;WesternBlot检测凋亡相关蛋白的变化;CM-H2DCFDA荧光探针标记检测细胞内活性氧(Reactiveoxygenspecies,ROS)水平;最后使用泛Caspase家族激酶抑制剂Z-VAD-FMK和各种抗氧化剂干预细胞后,观察细胞凋亡的变化。
　　结果:WA在体外对多种人胰腺癌细胞株均有一定的增殖抑制和凋亡诱导作用,且这种作用呈浓度和时间依赖性,但其对人正常细胞株的增殖抑制作用较小;WA可诱导人胰腺癌细胞线粒体膜电位下降,并阻滞细胞周期于G2/M期;WesternBlot结果显示,WA能引起Caspase-3、Caspase-9、PARP1的剪切激活和Bax/Bcl-2比值上调;而Z-VAD-FMK可部分逆转WA所诱导的细胞凋亡效应;同时WA还可显著增加细胞内的ROS水平,但当使用抗氧化剂NAC和Catalase清除细胞内ROS后,细胞凋亡率也明显减少。
　　结论:WA在体外可显著抑制人胰腺癌细胞增殖,并阻滞细胞周期于G2/M期;WA能够诱导细胞发生凋亡,且这种凋亡依赖于Caspase家族的激活;另外,WA还可引起细胞内ROS水平显著增加,而WA诱导的细胞凋亡依赖于这种ROS的产生。
　　第二部分醉茄素A诱导保护性自噬作用的体内外研究
　　目的:通过体内外实验研究WA是否诱导人胰腺癌细胞发生自噬及其生物学意义。
　　方法:采用透射电子显微镜观察细胞超微结构的变化。WesternBlot检测自噬关键蛋白LC3B的表达情况。构建pEGFP-LC3质粒稳定转染细胞株,激光共聚焦显微镜观察细胞内绿色GFP-LC3点状阳性细胞数比例。利用溶酶体探针LysoTrackerRedDND-99检测GFP-LC3与溶酶体之间的空间定位关系。采用多种自噬抑制剂及RNAi技术沉默自噬关键基因Atg5后检测细胞增殖和凋亡的变化。最后通过建立Panc-1裸鼠皮下移植瘤模型,在动物水平观察单用WA或联合使用自噬阻滞剂氯喹(chloroquine,CQ)后对胰腺癌细胞血管生成、增殖、凋亡和自噬等生物学特性的影响。
　　结果:透射电镜结果显示,WA作用后细胞质中可见大量空泡化双层膜结构及自噬体形成;WesternBlot结果显示,WA可诱导自噬关键蛋白LC3B-Ⅱ的表达增加;激光共聚焦结果显示,WA可诱导稳定转染pEGFP-LC3质粒的细胞出现大量GFP-LC3点状聚集,并且这种绿色GFP-LC3与红色LysoTrackerRed共定位;使用自噬溶酶体抑制剂与WA联合作用后,细胞内绿色GFP-LC3点状聚集进一步增多,且WesternBlot显示LC3B-Ⅱ的表达也进一步增加;但另一种自噬阻滞剂3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)以及泛Caspase家族激酶抑制剂Z-VAD-FMK却对WA诱导的LC3B-Ⅱ的表达无显著影响;而当自噬溶酶体抑制剂与WA联用后可增强其抑制细胞增殖和诱导凋亡的效应;同样,当使用RNAi技术沉默自噬关键基因Atg5来抑制自噬后,可显著增加WA诱导的细胞凋亡;裸鼠皮下移植瘤模型结果显示:药物干预21天后,单用WA组的肿瘤体积和重量与对照组相比均有一定程度的减小(P<0.05);而当联合使用自噬阻滞剂CQ后,肿瘤体积和重量均较单用WA组进一步减小(p<0.05);免疫组化结果显示,单用WA组移植瘤组织血管标记蛋白CD34和肿瘤增殖抗原Ki67的表达较对照组均有一定程度的减少,而自噬相关蛋白p62/SQSTM1和LC3B的表达均明显增加(P<0.05);当联合使用CQ后CD34和Ki67的表达较单用WA组进一步下降(p<0.05),而p62/SQSTM1和LC3B的表达则进一步增加(P<0.05);Tunel检测显示单用WA组较空白对照组细胞凋亡率升高(P<0.05),而联合使用CQ后细胞凋亡率进一步增加(P<0.05)。
　　结论:WA在体内、体外均可诱导人胰腺癌细胞发生自噬,且自噬可能是作为一种保护性应激反应来对抗细胞凋亡;WA诱导的细胞自噬不能被Caspase家族激酶抑制剂Z-VAD-FMK所阻滞,且不依赖于ClassⅢPI3K通路;单用WA可部分抑制裸鼠皮下移植瘤生长,而联合自噬阻滞剂CQ后可显著抑制移植瘤生长并促进其凋亡。
　　第三部分内质网应激反应对醉茄素A诱导人胰腺癌细胞凋亡和自噬的影响及其机制研究
　　目的:探讨内质网应激反应对WA诱导胰腺癌细胞凋亡和自噬的影响及其分子机制。
　　方法:采用WesternBlot检测相关蛋白的变化;观察抑制mTOR通路后对WA诱导的细胞凋亡和自噬的影响;采用间接免疫荧光法和透射电镜观察细胞内质网结构的改变;间接免疫荧光法检测泛素化蛋白(ubiquitin)、p62/SQSTM1蛋白和GFP-LC3的共定位;采用免疫共沉淀技术检测p62/SQSTM1与LC3B蛋白之间的相互作用关系;分别观察内质网应激保护剂Salubrinal和内质网应激诱导剂衣霉素(Tunicamycin,TM)对WA诱导的细胞凋亡和自噬的影响;RNAi技术分别沉默相关关键基因CHOP、Atg5、p62/SQSTM1后检测细胞泛素化蛋白、内质网应激相关蛋白以及凋亡和自噬的变化;最后观察抗氧化剂NAC对细胞内质网应激和自噬的影响。
　　结果:WA诱导人胰腺癌细胞p62/SQSTM1表达上调,但对其它自噬相关蛋白影响不大;WA能抑制PI3K-AKT-mTOR信号通路,而抑制mTOR通路后能进一步增加细胞自噬并部分逆转WA所诱导的细胞凋亡效应;WA诱导人胰腺癌细胞泛素化蛋白聚集,且聚集的泛素化蛋白与GFP-LC3共定位;WA诱导人胰腺癌细胞发生内质网应激反应,而抑制内质网应激可减少WA诱导的细胞凋亡和自噬;相反,促进内质网应激可增加WA诱导的细胞凋亡和自噬;并且,抑制细胞自噬可增强WA诱导的泛素化蛋白聚集及内质网应激反应。WA上调p62/SQSTM1的基因转录水平,但不影响其蛋白降解,且p62/SQSTM1与LC3B蛋白为相互作用蛋白;下调p62/SQSTM1后可增强WA诱导的细胞凋亡、自噬和内质网应激反应。最后,WA诱导的内质网应激和自噬反应均可被抗氧化剂NAC所阻断。
　　结论:ROS介导的内质网应激反应参与了WA诱导的人胰腺癌细胞凋亡和自噬;WA诱导胰腺癌细胞发生自噬依赖于PI3K/AKT/mTOR信号通路;抑制自噬或增加内质网应激均可显著增强WA对胰腺癌细胞的杀伤作用;p62/SQSTM1介导了自噬溶酶体清除泛素化蛋白和错误未折叠蛋白的过程,并增强了胰腺癌细胞对WA的凋亡抵抗作用。

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英文摘要

英文缩略语对照表

第一部分 醉茄素A通过氧化应激损伤诱导人胰腺癌细胞凋亡

1.1 前言

1.2 材料和方法

1.2.1 材料

1.2.2 方法

1.3 结果

1.3.1 WA抑制人胰腺癌细胞增殖

1.3.2 WA诱导人胰腺癌细胞形态学改变

1.3.3 WA诱导人胰腺癌细胞周期阻滞于G2/M期

1.3.4 WA诱导人胰腺癌细胞凋亡

1.3.5 WA诱导的细胞凋亡依赖于ROS的产生

1.4 讨论

小结

参考文献

第二部分 醉茄素A诱导保护性自噬作用的体内外研究

2.1 前言

2.2 材料和方法

2.2.1 材料

2.2.2 方法

2.3 结果

2.3.1 WA体外诱导人胰腺癌细胞自噬

2.3.2 WA诱导的自噬不依赖于Class Ⅲ PI3K通路

2.3.3 抑制自噬增强WA诱导的细胞凋亡

2.4 讨论

小结

参考文献

第三部分 内质网应激反应对醉茄素A诱导人胰腺癌细胞凋亡和自噬的影响及其机制研究

3.1 前言

3.2 材料和方法

3.2.1 材料

3.2.2 方法

3.3 结果

3.3.1 WA诱导人胰腺癌细胞p62/SQSTM1表达上调

3.3.2 WA抑制胰腺癌细胞PI3K-AKT-mTOR信号通路

3.3.3 抑制mTOR通路后能部分逆转WA诱导的细胞凋亡

3.3.4 WA诱导泛素化蛋白聚集

3.3.5 内质网应激参与了WA诱导的细胞凋亡和自噬效应

3.3.6 自噬参与了泛素化蛋白的降解和减轻WA诱导的内质网应激效应

3.3.7 p62/SQSTM1介导了自噬溶酶体清除泛素化错误折叠蛋白的过程

3.3.8 WA诱导的内质网应激和自噬反应依赖于ROS的产生

3.4 讨论

小结

参考文献

全文总结

本研究的意义和创新点

附：文 献 综 述

附录

经费来源

致谢