miR-34a介导上皮间质转化在胰腺癌发生发展中作用及机制研究

摘要

目的:
　　慢性胰腺炎是胰腺癌发生的危险因素,有研究表明上皮间质转化(EMT)与慢性炎症疾病及肿瘤发生发展密切相关。另有研究证实,microRNA参与肿瘤细胞EMT的过程。因此,本研究旨在探讨慢性胰腺炎以及胰腺癌中的EMT现象,并进一步阐明microRNA调控EMT参与胰腺癌发生发展的具体机制。
　　方法:
　　本研究通过免疫组织化学(IHC)和实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)法检测54例PDAC、26例CP和27例癌旁NP组织中EMT相关标志(E-cadherin、N-cadherin、Snail、ZEB1以及TWIST)的表达。并通过co-localization免疫双荧光技术检测了上述3种类型胰腺组织细胞内上皮标志(E-cadherin)以及间质标志(vimentin)的表达;通过IHC和qPCR法检测3种类型胰腺组织中miR-34a及其下游靶基因SIRT1和Notch1的表达情况,并通过回归分析比较验证了组织中miR-34a与SIRT1、Notch1和E-cadherin之间的相关性;体外通过TGF-β诱导胰腺癌细胞株(AsPC-1、BxPC-3、PANC-1、MiaPaCa-2、SW1990)产生EMT,并通过细胞形态、EMT相关标志、细胞生物学行为改变明确胰腺癌细胞是否发生EMT;应用qPCR和westernblot检测TGF-β诱导发生EMT的胰腺癌细胞miR-34a及其下游靶基因SIRT1和Notch1的表达水平;分别上调或抑制miR-34a、SIRT1及Notch1的表达证实miR-34a-SIRT1/Notch1信号通路在胰腺癌细胞发生EMT中的作用;此外,通过比较miR-34a与胰腺癌临床资料特征(性别、年龄、肿瘤大小、组织学分级、肿瘤的临床分期、淋巴转移、血管浸润和远处转移)之间的相关性,进一步阐明miR-34a介导的EMT在胰腺癌发生发展中的作用。
　　结果:
　　与NP组织相比,CP及PDAC组织中E-cadherinmRNA及蛋白的表达水平明显下调(p<0.05),而间质标志物N-cadherin,促进EMT转录因子Snail以及ZEB1则表达明显增加(p<0.05).荧光双标免疫组织化学结果证实慢性胰腺炎以及胰腺癌组织中存在显著活化的EMT过程。此外,miR-34a在CP及PDAC组织中表达显著减少(p<0.05),而其下游靶基因SIRT1及Notch1则表达均上调(p<0.05)。miR-34a与SIRT1及Notch1的表达呈负相关,而同上皮标志E-cadherin的表达呈正相关。TGF-β的诱导培养或通过miR-34ainhibitors抑制miR-34a的表达均可使胰腺癌细胞发生EMT样改变,而通过转染miR-34amimics或是通过干扰SIRT1或Notch1都不同程度抑制胰腺癌细胞发生上皮间质转化。临床病理特征相关性分析发现,miR-34a与较晚胰腺癌分期,淋巴转移、血管浸润、以及远处转移呈正相关。
　　结论:
　　本实验证实在CP及PDAC组织均存在EMT,而慢性炎症环境中重要炎性细胞因子TGF-β通过调控miR-34a-SIRT1/NOTCH1信号通路介导胰腺癌细胞的EMT,提示慢性炎症微环境通过诱导EMT参与CP向PDAC的恶性转化过程。

目录

封面

声明

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前言

参考文献

中文摘要

英文摘要

一般资料

1. 组织标本来源

2. 患者资料

材料与方法

1. 主要仪器和设备

2．主要试剂

3. 细胞株

4.实验方法

结果

1. 慢性胰腺炎及胰腺癌组织中发现上皮间质转化（EMT）现象

2.miR-34a-SIRT1/Notch1 通路介导了慢性胰腺炎及胰腺癌中的上皮间质转化（EMT）

3.miR-34a-SIRT1/Notch1信号通路介导了TGF-β诱导的胰腺癌细胞EMT

4. miR-34a的表达水平同胰腺癌患者临床病理特点的相关性

讨论

参考文献

综述

致谢

附录一 在校攻读学位期间发表论文

附录二 英文缩略表