TLR2对角质形成细胞与不同皮肤癣菌共孵育时的影响研究

摘要

第一部分角质形成细胞对不同皮肤癣菌生长的抑制作用及封闭TLR2对其的影响
　　目的：
　　研究角质形成细胞对红色毛癣菌、犬小孢子菌及石膏样小孢子菌生长的抑制作用以及封闭TLR2对上述作用的影响。
　　方法：
　　将培养在含10％胎牛血清的DMEM培养基中的角质形成细胞在5%CO2、37℃环境下进行孵育,当细胞生长到80%左右时分为两组,以无血清培养基配置的菌丝悬液(悬液浓度为4×105/ml)替代原培养液继续培养为刺激组(即A组),阻断组(即B组)则先加入TLR2抗体(使抗体浓度达到20ug/ml),37℃孵育1小时以阻断TLR2的作用,再加入菌悬液,同时设立无细胞生长的培养基加入菌丝段悬液为空白对照。分别制备在不同时间点(4h、8h、16h和24h)共孵育后的菌丝段悬液,通过台盼蓝染色计数法计算得出真菌的生长抑制率。
　　结果：
　　在角质形成细胞和菌丝段悬液共孵育的不同时间点,采用台盼蓝染色计数法检测的结果为:红色毛癣菌刺激组生长抑制作用4h即显现,16h可达(67.8%±3.1%),封闭TLR2后的阻断组生长抑制作用减弱,封闭前后生长抑制作用差异有统计学意义(P<0.05);刺激组犬小孢子菌4h生长抑制率为41.8%±2.5%,随时间推移,16h达70.0%±6.8%,24h逐渐下降,封闭TLR2后的阻断组在各时间点生长抑制作用均明显下降,阻断前后生长抑制作用差异皆有统计学意义(P<0.05);刺激组石膏样小孢子菌随共孵育时间的延长生长抑制作用逐渐加强,24h达63.0%±3.5%,封闭TLR2阻断组4h生长抑制率为15.6%±1.7%,且各个时间点生长抑制作用均减弱,阻断前后差异有统计学意义(P<0.05)。
　　结论：
　　角质形成细胞与体外培养的亲人性红色毛癣菌、亲动物性犬小孢子菌及亲土性石膏样小孢子菌共孵育时对其均有抑制作用;阻断TLR2后此抑制作用明显减弱,TLR2在角质形成细胞抑制不同皮肤癣菌生长的过程中产生重要的影响。
　　第二部分TLR2在不同皮肤癣菌感染中对角质形成细胞分泌炎症细胞因子的影响
　　目的：
　　观察红色毛癣菌、犬小孢子菌及石膏样小孢子菌与角质形成细胞共孵育后炎症细胞因子IL-6、IL-8及TNF-α的表达变化,以及中和TLR2前后上述因子的变化情况,探讨TLR2在皮肤癣菌感染中发挥的作用。
　　方法：
　　角质形成细胞与上述三种皮肤癣菌菌悬液分别共孵育,角质形成细胞直接与悬液共孵育为刺激组(即A组),阻断组(即B组)为先阻断TLR2后角质形成细胞再与三种皮肤癣菌共孵育,采用酶联免疫复合物法(ELISA)检测不同时间点细胞上清中IL-6、IL-8及TNF-α的浓度,比较中和TLR2抗体前后各种细胞因子的浓度变化情况,同时设置阴性对照。
　　结果：
　　红色毛癣菌刺激角质形成细胞后刺激组IL-8浓度明显升高,在各时间点分别与对照组、阻断组比较差异有统计学意义(P<0.05);刺激组IL-6及TNF-α浓度8h分泌明显增加,且随时间延长其浓度不断升高,24h分别达(498.133±20.159)pg/ml和(32.133±3.674)pg/ml,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05),封闭TLR2阻断组IL-6及TNF-α浓度下降,刺激组和阻断组8h、16h和24h差异均有统计学意义(P<0.05)。
　　犬小孢子菌刺激角质形成细胞后IL-8表达量随时间推移逐渐增多,4h浓度即可达到(542.867±37.846)pg/ml,24h升高到(671.358±26.247)pg/ml,阻断TLR2后则表达明显降低,各时间点刺激组与对照组、刺激组与阻断组比较差异均有统计学意义(P<0.05);刺激组IL-6、TNF-α在4h及8h时浓度无显著变化,16小时后分泌量明显增加,且随时间推移逐渐增多,阻断TLR2后各时间点IL-6、TNF-α表达降低,其中16h和24h时刺激组与阻断组、刺激组与对照组差异有统计学意义(P<0.05)。
　　石膏样小孢子菌刺激角质形成细胞后刺激组IL-8浓度在各时间点均升高,分别与对照组及阻断组之间差异均有统计学意义(P<0.05);刺激组IL-6不同时间点动态表达量不同,4h和8h刺激组与对照组、刺激组与阻断组比较无明显统计学差异(P>0.05),而在16h和24h时刺激组浓度分别可达到(38.70±8.41)pg/ml、(51.70±10.32)pg/ml,与阻断组及对照组比较差异有统计学意义(P<0.05);刺激组TNF-α浓度16h方升高明显,24h达(40.61±5.94)pg/ml,与阻断组及对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。
　　结论：
　　红色毛癣菌、犬小孢子菌及石膏样小孢子菌分别刺激角质形成细胞后,均可使角质形成细胞分泌IL-6、IL-8及TNF-α的量增加,阻断TLR2各细胞因子表达量降低;TLR2在角质形成细胞抗不同肤癣菌感染时分泌IL-6、IL-8及TNF-α的过程中起到重要的调节作用。

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英文摘要

前言

第一部分 角质形成细胞对不同皮肤癣菌生长的抑制作用及封闭TLR2对其的影响

材料和方法

1. 实验细胞及菌株

2. 主要的仪器设备

3. 主要试剂

4. 真菌培养及菌悬液的制备

5. 实验分组及处理

6. 采集实验标本

7. 三种癣菌活力的判断及生长抑制率的计算

8. 统计学分析

结果

1.阻断TLR2前后角质形成细胞对红色毛癣菌生长抑制率的比较

2.阻断TLR2前后角质形成细胞对犬小孢子菌生长抑制率的比较

讨论

小结

第二部分 TLR2在不同皮肤癣菌感染中对角质形成细胞分泌炎症细胞因子的影响

材料和方法

1. 实验细胞及菌株

2. 主要的仪器设备

3. 主要试剂

4. 真菌培养及菌悬液的制备

5. 实验分组及处理

6.细胞因子测定

7. 统计学分析

结果

1.红色毛癣菌与封闭TLR2前后的角质形成细胞共孵育时IL-6、IL-8及TNF-α表达的比较

2.犬小孢子菌与封闭TLR2前后的角质形成细胞共孵育时IL-6、IL-8及TNF-α表达的比较

3.石膏样小孢子菌与封闭TLR2前后的角质形成细胞共孵育时IL-6、IL-8及TNF-α表达的比较

讨论

小结

参考文献

综述

致谢