豆豉纤溶酶高产菌株XY-1的诱变育种及产酶条件研究

摘要

目的:
　　通过诱变育种方法获得纤溶酶高产菌株。通过单因素实验和正交实验研究得到突变株最佳发酵条件。
　　方法:
　　采用紫外线诱变的方法,对本实验室保存的产纤溶酶菌株XY-1进行育种;采用传代培养的方式选取能够稳定遗传的突变株;用PCR的方法扩增突变株与出发菌株的产酶基因,用PubMed的BLAST比较它们的基因是否有差异;用摇瓶实验与测量OD600相结合的方法研究出发菌株和突变菌株的生长量,探索两者的差别;用摇瓶发酵培养的方法得到出发菌株和突变菌株的产酶曲线,比较两者的区别;用摇瓶发酵培养的方式分别发酵培养出发菌株和突变菌株获得两种酶,粗酶在-20℃,4℃,室温,37℃,40℃,50℃,60℃,70℃下保存处理不同时间,比较处理后的酶的活性,得到两者酶的热稳定性。
　　采用单因素实验分别从葡萄糖,蔗糖,木糖,麦芽糖,乳糖,可溶性淀粉和蛋白胨,硫酸铵,大豆蛋白胨,胰蛋白胨,酵母浸膏,牛肉浸膏分别选出突变株的最佳碳氮源;4因素3水平的正交试验优化发酵培养基的组成成分;采用单因素实验探索突变株的培养条件:温度,接种量,初始pH。
　　结果:
　　通过紫外诱变获得了2株能够稳定遗传10代的突变株WY-1和WY-2,其产酶量均达到出发菌的3倍。出发菌株与突变菌株的产酶基因序列中只有一个碱基不同,其相似度达到99％,两者无差异。出发菌株和突变菌株的生长速率相同,即达到对数生长期和维持对数生长期的时间相同,相同培养时间的生长量不同,突变菌株高于出发菌株。出发菌株和突变菌株的产酶速率不同,出发菌株在17h达到产酶高峰,产酶量为13.8FU/ml,培养至第9天时酶产量没有明显下降;突变菌株在3天达到产酶高峰,这时候的产酶量为43.67FU/ml,六天后产酶量开始呈现下降趋势,第9天下降至35FU/ml。突变菌的产酶量为出发菌株的3.15倍。两种酶的热稳定性相似,在-20℃,4℃,室温下,两种粗酶在16天时还具有80%以上的酶活性;在37℃和40℃时酶稳定性相似,5.5h能保存80%的酶活性,高于50℃时酶的热稳定性明显下降。
　　基单因素实验提示发酵培养最佳碳源为麦芽糖,最佳氮源为蛋白胨。正交试验得到发酵培养基的成分为:碳源浓度为2%,氮源浓度为3%,K2HPO4/KH2PO4为0.2%/0.1%,硫酸镁为0.1%。研究得到最佳培养条件为:培养时间为72h,温度为37℃,初始pH为7,菌种接种量为0.5%。
　　结论:
　　紫外诱变获得高产菌株,纤溶酶产量为43.67FU/ml,为出发菌株的3.15倍,达到了诱变育种的预期效果。培养条件优化后突变菌株纤溶酶产量达到53FU/ml,是优化之前的1.65倍。

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前言

第一部分 豆豉产纤溶酶产生菌的诱变育种

1. 实验材料

1.1 仪器

1.2 试剂

1.3 菌株

1.4 培养基及主要溶液

2. 实验方法

2.1 菌种活化

2.2 生长曲线的测定（生长量测定）

2.3 制备细胞悬浮液

2.4紫外线照射致死量测定

2.5 诱变菌株初筛：牛奶琼脂平板法

2.6 突变株半定量复筛

2.7 诱变菌株定量复筛

2.8 反复诱变育种

2.9 稳定遗传鉴定试验

2.10 扩增细菌产酶基因

2.11 酶的稳定性试验

2.12 出发菌株和突变菌株的生长曲线

2.13 酶产量随培养时间变化

3.结果与讨论

3.1 生长曲线

3.2 紫外照射致死率曲线

3.3 细菌筛选结果

3.4 突变菌株和出发菌株的产酶基因

3.5 粗酶在不同温度下的保存时间

3.6 酶的稳定性实验

3.7 突变菌株和出发菌株生长曲线的比较

3.8 培养时间与酶产量的关系

4. 结论

第二部分 突变菌株WY-1发酵条件的研究

1. 实验材料

1.1 仪器

1.2 试剂

1.3 菌株

1.4 培养基及主要溶液

2. 实验方法

2.1突变菌株活化

2.2发酵培养基优化

2.3 发酵条件优化

3. 实验结果

3.1发酵培养基优化

3.2 发酵条件的优化

4. 结论

总结

参考文献

综述

致谢