结直肠癌肿瘤干细胞分选及131I标记AC133 mAb对荷瘤裸鼠模型的体内示踪研究

摘要

目的
　　1.采用免疫磁珠分选系统(MACS)从结直肠癌LoVo细胞中分选CD133(+)细胞,研究CD133(+)细胞的肿瘤干细胞特性。
　　2.标记AC133mAb制备抗体探针,通过体外实验明确抗体探针的放化纯、稳定性、特异性及免疫活性。
　　3.采用抗体探针对肿瘤干细胞进行体内示踪,通过生物分布、分子生物学技术及放射自显影(ARG)明确抗体探针的靶向性。
　　方法
　　1.肿瘤干细胞的分离、培养及鉴定
　　制备LoVo细胞单细胞悬液,加入FcRBlockingReagent、CD133MicroBeads孵育,孵育细胞分别过MS柱及LD柱获得CD133(+)细胞及CD133(-)细胞。分选细胞在含表皮生长因子(epidermalgrowthfactor,EGF)和碱性成纤维生长因子(basicfibroblastgrowthfactor,bFGF)的无血清培养基(serumfreemedium,SFM)中培养,观察其成球性。采用流式细胞术及细胞免疫荧光鉴定分选细胞纯度。通过流式细胞术检测培养过程中CD133表达率,对比加入胎牛血清前后形态学及CD133表达率的变化。采用CCK-8法检测5-FU对分选细胞的毒性。对比CD133阳性细胞和阴性细胞在BALB/c裸鼠体内的成瘤性差异。
　　2.AC133mAb的标记、纯化、放化纯、稳定性测定及细胞结合实验
　　采用腹水法制备AC133mAb并纯化。通过Iodogen法用131I标记抗体,按抗体重量(mg)与131I放射性活度(mCi)比值1:30进行标记。采用离心超滤法纯化标记抗体,计算标记率。通过ITLC测定标记抗体的放化纯,并检测其体外稳定性。设LoVo细胞、CD133(+)细胞、CD133(-)细胞及LoVo细胞未标记抗体阻断组,检测标记抗体孵育15min、30min、60min、120min及240min后各组细胞的结合率。
　　3.荷瘤裸鼠SPECT/CT显像及生物分布
　　建立未分选、CD133(+)及CD133(-)LoVo细胞的BALB/c荷瘤裸鼠动物模型。尾静脉注射14.8MBq~18.5MBq(400μCi~500μCi)131I-AC133mAb,分别于注射后1、3、5、7天用SPECT/CT采集图像。显像结束后取裸鼠肿瘤及部分器官组织,测量每克组织百分注射剂量率(％ID/g)。
　　4.肿瘤组织免疫荧光、Westernblot及放射自显影
　　显像后取移植瘤、肝脏、肾脏及肌肉组织,采用Westernblot检测CD133表达量;制备组织冰冻切片,通过免疫荧光检测各组织CD133的表达;通过放射自显影检测标记抗体在各组织的放射性分布。
　　结果
　　1.MACS分选结果鉴定
　　MACS分选后,FCM检测分选阳性细胞CD133表达率为81.30%±1.83%,明显高于分选阴性细胞(0.98%±0.79%)及未分选细胞组(48.23%±2.15%)(P<0.05)。免疫荧光显示分选阳性细胞膜表面见强荧光,而在阴性细胞表面仅见微弱荧光。
　　2.肿瘤干细胞特性鉴定
　　CD133(+)细胞在SFM培养下见明显悬浮肿瘤球,加入10%胎牛血清培养后肿瘤球消失,呈贴壁生长。CD133(+)细胞在SFM中CD133表达率下降缓慢,加入胎牛血清后CD133表达率迅速下降。而CD133(-)细胞始终低表达CD133。CD133(+)细胞比CD133(-)细胞具有更强的耐药性和成瘤性。
　　3.131I-AC133mAb性质鉴定
　　抗体标记率为68.98%±11.95%,纯化后放化纯为84.35±0.45%,体外7天内稳定。CD133(+)细胞与标记抗体的结合率在孵育2h后达高峰,为70.01%±6.02%,明显高于未分选LoVo细胞(30.52%±1.14%),CD133(-)细胞(2.39%±0.26%)及特异性阻断组(2.73%±0.25%)(P<0.05)。
　　4.体内显像及生物分布
　　131I-AC133mAb在CD133(+)、LoVo移植瘤逐渐浓聚,7天时显像清晰。CD133(-)及阻断组移植瘤始终显影较淡。肝脏、脾脏、肾脏、心脏及肺脏显像剂浓聚明显。
　　生物分布显示,IV注射131I-AC133mAb后7天,LoVo和CD133(+)移植瘤%ID/g分别为6.12±1.91和6.97±1.40,明显高于CD133(-)移植瘤(1.35±0.48)及阻断组移植瘤(1.61±0.44)(P<0.05)。肝脏、脾脏、肾脏、心脏及肺脏%ID/g较低,血液%ID/g较高。
　　5.离体实验研究结果
　　免疫荧光及Westernblot显示CD133(+)细胞、LoVo细胞及阻断组移植瘤高表达CD133,CD133阴性细胞移植瘤、肌肉中几乎无表达。ARG显示CD133(+)细胞、LoVo细胞移植瘤组织中有明显的放射性浓聚;CD133(-)细胞移植瘤、阻断组移植瘤、肝脏、肾脏及肌肉中有少量的显像剂浓聚。
　　结论
　　CD133(+)LoVo细胞具有肿瘤干细胞特性。131I-AC133mAb具有良好的放化纯、稳定性、特异性和免疫活性。标记抗体在CD133(+)肿瘤部位特异性浓聚,应用131I-AC133mAb进行SPECT/CT可以无创监测肿瘤干细胞。

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封面

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前言

参考文献

中文摘要

英文摘要

第一部分LoVo细胞系中肿瘤干细胞的分离、培养及鉴定

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

第二部分131I标记AC133mAb对结直肠癌肿瘤干细胞的示踪研究

绪言

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

全文总结

本研究完成的研究成果

下一步的研究方向

综述

致谢

附 录1

附 录2