microRNA-155抑制序列减轻CD4+T细胞激活所致内皮细胞炎症反应和平滑肌细胞增殖

摘要

研究目的：
　　流行病学研究提示microRNA-155在外周血的表达水平与T细胞对于oxLDL的抗原反应性存在正性相关,且两者随着患者年龄的增大都逐渐降低。本研究旨在阐明microRNA-155抑制序列能够影响CD4+T细胞的增殖和分化,进而减轻共培养体系中内皮细胞炎症反应和平滑肌细胞增殖。
　　研究方法：
　　分离脐血中的造血干细胞和幼稚CD4+T细胞。使用SCF、GM-CSF和TNF-α诱导造血干细胞分化为幼稚DC,随后加入oxLDL使之转化为oxLDL特异性的成熟DC。同时利用IL-2、IL-4、IL-7使CD4+T细胞保持增殖状态,并分别使用包含有microRNA-155抑制序列的慢病毒颗粒和空载慢病毒颗粒(MOI=10)转染之。将成熟DC辐照灭活后以1:10的比例与野生组、抑制病毒转染组、空白病毒转染组幼稚CD4+T细胞共培养,使各组CD4+T细胞对于oxLDL产生特异性免疫。
　　使用oxLDL持续刺激各组CD4+T细胞3d,之后利用CFSE检测T细胞的增殖,利用流式细胞仪各组T细胞亚群的比例,利用realtime-PCR检测IL-2、IL-4、IL-10、TNF-α、TGF-β、HB-EGF和bFGF等的mRNA表达,并评价各组T细胞对于炎症反应内皮细胞的粘附性。
　　以transwell小室为基础构建体外血管壁模型。将与脐血来源于同一供体的脐静脉内皮和脐动脉平滑肌分别接种于PET膜的两个侧面并培育7d,使两种细胞之间通过微孔形成缝隙连接。
　　将各组oxLDL特异性CD4+T细胞以10:1的比例与内皮细胞和平滑肌细胞共培养3d,利用流式细胞仪检测内皮细胞CD80、CD86、VCAM和HLA-DR的表达量,利用JC-1检测反映内皮细胞早期凋亡的线粒体膜电位,并利用EMSA检测内皮细胞NK-κB通路的激活情况。在平滑肌细胞方面则进行划痕试验、细胞周期检测和EdU渗入实验,并使用realtime-PCR检测CNN、TAGLN和ACTA的mRNA表达量,利用EMSA检测Wnt通路的激活情况。
　　采用SPSS16.0软件对所得数据进行统计学分析,使用不完全匹配的、双尾的、学生t检验,P<0.05,差异有统计学意义。
　　研究结果：
　　在oxLDL刺激3d后,转染microRNA-155抑制序列的CD4+T细胞中Th2和Treg细胞的百分比明显高于野生组和空白病毒转染组(P<0.05),IL-2、TNF-α、HB-EGF和bFGF的mRNA表达量明显低于野生组和空白病毒转染组(P<0.05),而IL-4、IL-10和TGF-β明显高于其余两组(P<0.05)。同时转染microRNA-155抑制序列会明显抑制CD4+T细胞的增殖(P<0.05),同时对于细胞粘附产生影响(P<0.05)。
　　将各组CD4+T细胞与以transwell小室基础的体外血管壁模型共培养,转染抑制序列的CD4+T细胞可以明显减轻内皮细胞表面CD80、CD86、VCAM和HLA-DR的表达量(P<0.05)和细胞凋亡(P<0.01),同时NF-κB通路的激活程度也相应减低。平滑肌细胞划痕实验等显示转染microRNA-155抑制序列的CD4+T细胞能够减轻细胞增殖,同时在12h时减轻CNN、TAGLN和ACTA的mRNA表达量(P<0.02),并降低Wnt通路的激活程度。
　　研究结论：
　　减少CD4+T细胞中microRNA-155的表达会抑制T细胞的激活和增殖,并使之向Th2和Treg方向分化,进而改变细胞因子分泌谱。CD4+T细胞的这种改变会减轻内皮细胞的炎症反应和平滑肌的增殖。

目录

封面

声明

目录

缩略词表

中文摘要

英文摘要

前言

第一部分 microRNA-155抑制序列对于CD4+T细胞的影响

1.实验材料

1.1 实验标本

1.2主要设备和仪器

1.3主要实验试剂

2.实验方法

2.1分离和扩增造CD34+血干细胞

2.2树突状细胞诱导分化

2.3脐血CD4+幼稚T细胞的分离与扩增

2.4 内皮细胞的分离与培养

2.5 分离和培养平滑肌细胞

2.6低密度脂蛋白（LDL）的分离和氧化

2.7 幼稚CD4+T细胞的转染

2.8 转染与非转染CD4+T细胞的激活

2.9共培养模型的建立

2.10淋巴细胞粘附实验

2.11 Th细胞亚群的鉴定

2.12免疫荧光：

2.13淋巴细胞增殖检测

2.14细胞周期检测

2.15实时PCR反应

2.16线粒体膜电位检测

2.17电泳迁移率实验

2.18. 统计学方法

3.结 果

micrRNA-155抑制序列降低激活后CD4+T细胞内microRNA-155的表达

microRNA-155抑制序列降低CD4+T细胞增殖水平

microRNA-155抑制序列影响幼稚CD4+T细胞的分化

microRNA-155抑制序列降低CD4+T细胞的粘附能力

microRNA-155抑制序列对于各细胞因子mRNA表达量的影响

免疫荧光鉴定内皮细胞和平滑肌细胞

microRNA-155抑制序列减轻CD4+T细胞激活所致内皮细胞的炎症反应

microRNA-155抑制序列减轻CD4+T细胞激活所致内皮细胞的早期凋亡

microRNA-155抑制序列减轻CD4+T细胞激活所致内皮细胞的NF-κB通路激活水平

microRNA-155抑制序列减轻CD4+T细胞激活所致平滑肌细胞的DNA合成水平

microRNA-155抑制序列改善CD4+T细胞激活所致平滑肌细胞周期的变化

microRNA-155抑制序列减轻CD4+T细胞激活所致平滑肌细胞的Wnt通路激活水平

Realtime-PCR测定平滑肌增殖相关蛋白mRNA表达水平

4.讨 论

参考文献

致谢