IFN-γ诱导支气管上皮细胞高表达Galectin-9介导造血干细胞移植后肺免疫保护及机制的研究

摘要

第一部分肺在急性移植物抗宿主病中的相对免疫逃逸效应
　　目的:目前肺在急性移植物抗宿主病中是否受到免疫攻击而被赦免尚存在争议。建立一个成熟可靠的小鼠移植后肺免疫保护模型,为后期异基因移植后肺免疫保护的深入研究提供理想的实验模型和依据。
　　方法:建立小鼠aGVHD模型,分别是C57BL/6J→C57BL/6J,同基因组;C57BL/6J→B6D2F1同种异基因半相合组;C57BL/6J→BALB/C,脾与骨髓细胞为2:1;C57BL/6J→BALB/C,脾与骨髓细胞为4:1;移植成功后观察aGVHD临床评分和生存期,检测外周血白细胞计数和嵌合体,测肺、肝、肠、皮肤组织病理,ELISA检测移植后肺组织中IFN-γ水平。
　　结果:同种异基因组小鼠42天生存率为20％,在移植后28天小鼠出现GVHD典型临床表现和病理损伤,但肺组织损伤与经典靶器官肝、小肠、皮肤相比明显减轻,在同基因组中移植小鼠42天全部生存,无GVHD临床表现;而MHC完全不相合组出现严重的GVHD表现,移植后12天半数小鼠死亡,移植物脾和骨髓细胞为4:1组还出现严重的间质性肺炎改变;移植濒死状态的小鼠其外周血白细胞计数为(1.69±0.12)×109/L,在移植后第30天和60天可检测到供者型Y染色体;同种异基因组小鼠在移植后第1和2周肺组织中IFN-γ明显升高,其峰值为(188.6±12.7)pg/ml,而完全不相合组(2:1和4:1)在移植后第1和2周IFN-γ有轻度升高,与同种异基因组相比具有显著性差异(P<0.05)。
　　结论:造血干细胞移植后肺存在相对免疫赦免,它与输注的淋巴细胞数、肺内IFN-γ水平相关。
　　第二部分Galetin-9在急性移植物抗宿主病中的表达和作用
　　目的:体内探讨IFN-γ依赖性Gal-9在急性移植物抗宿主病中的表达和体内机制。
　　方法:建立小鼠aGVHD移植模型:C57BL/6J→C57BL/6J,同基因组;C57BL/6J→B6D2F1,野生型组;IFN-γ-/-→B6D2F1,供者IFN-γ-/-组;C57BL/6J→IFN-γR-/-,受者IFN-γR-/-组;观察移植后小鼠的生存期和临床评分,HE染色观察肺、肝、肠、皮肤组织病理,支气管肺泡灌洗术检测灌洗液中总细胞数、总蛋白量及肺湿/干比重;+7天Tunel检测肺中细胞凋亡,+28天流式和ELISA检测T细胞亚群和细胞因子水平;免疫组化、免疫荧光、ELISA和Westernblot检测肺、小肠、皮肤、肝中Gal-9的表达;为探讨Gal-9特异性的肺保护,对供者IFN-γ-/-组和受者IFN-γR-/-组经鼻灌注吸入Gal-9蛋白,观察小鼠生存期和肺病理,ELIAS检测IFN-γ、TNF-a、IL-4和IL-17变化。
　　结果:同基因移植组小鼠42天全部存活,无GVHD临床表现和病理改变;野生型组小鼠可有aGVHD表现,24天生存率为大于50%,在移植后28天肺组织病理改变比经典靶器官肝、小肠、皮肤明显轻微;供者IFN-γ-/-组和受者IFN-γR-/-组小鼠均有致死性GVHD表现,14天内全部死亡,肺组织出现严重病理改变,BALF中总细胞数和总蛋白量及肺湿/干比重在移植后1周明显增高;Tunel提示异基因组小鼠肺中存在大量凋亡细胞,供者IFN-γ-/-组和受者IFN-γR-/-组凋亡细胞很少见,流式和ELISA检测显示这两组小鼠在移植后第7天肺组织中CD4+和CD8+细胞明显升高;在供者IFN-γ-/-小鼠中IL-4明显升高,受者IFN-γR-/-组中IFN-γ和IL-17升高;免疫组化、免疫荧光、ELISA和Westernblot检测均发现在野生型小鼠肺中Gal-9高表达;经鼻灌注吸入Gal-9蛋白可显著改善供者IFN-γ-/-和受者IFN-γR-/-移植小鼠的生存期和肺组织病理,在供者IFN-γ-/-小鼠体内与IL-4和IL-17下降相关,而在受者IFN-γR-/-小鼠体内与IFN-γ和IL-17水平下降相关。
　　结论:IFN-γ依赖性Gal-9可促进活化T细胞亚群耗竭或/和其分泌的细胞因子降低,在造血干细胞移植后肺损伤的免疫保护中起重要作用。
　　第三部分IFN-γ促进支气管上皮细胞高表达Galectin-9经Casapse-3途径诱导T细胞凋亡
　　目的:体外探讨IFN-γ对支气管上皮细胞中Galectin-9的诱导及高表达的Galectin-9对T细胞凋亡的作用和机制。
　　方法:用纤支镜灌洗刷从正常人的支气管中段分离出支气管上皮细胞(HBE),用CK-18、CK-19和Vimentin鉴定支气管上皮细胞;用浓度为0,0.08,0.4,2,10,50ng/ml的IFN-γ和浓度为10ng/mlIFN-γ刺激支气管上皮细胞0,3,6,12,24,48h,Real-timePCR和Westernblot检测Gal-9表达;CD3+免疫磁珠分选人的T细胞,用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基,加入ConA和IFN-γ或IL-4或IL-17培养12小时,流式细胞仪检测T细胞亚群、CD69和Tim-3的表达率;将IFN-γ预处理的HBE与T细胞共培养24h,流式检测T细胞凋亡,采用Tim-3-FC阻断和Transwell培养进行阻断;分光光度仪检测T细胞凋亡中Caspase家族的活化,用Caspase-3(z-DEVD-fmk)或Caspase-4抑制剂(Ac-LEVD-cho)对比T细胞凋亡的影响。
　　结果:培养出的支气管上皮细胞中CK18和CK19大量表达,而vimentin无表达;IFN-γ诱导HBE高表达Gal-9,呈时间和浓度依赖性,其最佳诱导浓度和时间为10ng/ml和24h;免疫磁珠从外周单个核细胞分出T细胞(CD3+)比值为(86.2±5.21)%,ConA刺激T细胞后其CD69表达率为(72.11±3.14)%,加入IFN-γ、IL-4和IL-23其Th1、Th2和Th17细胞表达率分别为(71.3±2.09)%,(62.3±3.51)%,(42.3±6.12)%;将HBE与T细胞进行共培养,未采用IFN-γ预处理组的T细胞凋亡率为(1.9±0.12)%,用IFN-γ预处理组其T细胞凋亡率为(18.5±1.46)%,并可被Tim-3-FC部分阻断(8.1±0.33)%;在transwell共培养中,T细胞凋亡率为(12.6±2.31)%;分光光度计检测发现在IFN-γ预处理的HBE与T细胞共培养中,Caspase-3和Caspase-4活化水平上调,加入Caspase-3抑制剂后T细胞凋亡明显减少,为(13.4±2.13)%,但Caspase-4抑制剂后T细胞凋亡未见明显影响。
　　结论:IFN-γ诱导HBE高表达Gal-9,后者与活化T细胞上Tim-3相结合,呈caspase-3途径依赖性诱导Th1/Th17细胞凋亡。

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前言

第一部分 肺在造血干细胞移植中的相对免疫逃逸效应

材料和方法

一 实验动物

二 主要试剂

三 主要仪器

结果

一、移植小鼠的临床表现及生存期

二、移植后小鼠的白细胞观察

三、移植小鼠嵌合体检测

讨论

参考文献

第二部分 Galectin-9在aGVHD中的表达和作用

材料和方法

一 实验动物

二 主要试剂

三 主要仪器

结果

一、IFN-γ基因敲除小鼠的鉴定

二、移植小鼠的临床表现及生存期

三、组织病理学改变

四、支气管肺泡灌洗液和肺湿/干比重

五、移植后小鼠肺组织中细胞的凋亡和T细胞亚群的失调

六、Gal-9在造血干细胞移植后不同组织中的表达

七、外源性Gal-9蛋白对特发性肺炎综合征的免疫抑制作用

讨论

参考文献

第三部分 IFN-γ促进支气管上皮细胞高表达Gal-9经Caspase-3途径诱导T细胞凋亡

材料和方法

二 主要仪器

三 实验方法

结果

一.支气管上皮细胞培养和鉴定

二.IFN-γ诱导支气管上皮细胞表达Gal-9

三.T细胞的活化和亚群诱导

讨论

参考文献

综述

附录

致谢