神经调节蛋白1介导星形胶质细胞活化在慢性神经病理性疼痛发生发展中的作用研究

摘要

目的：
　　本研究拟通过体外培养星形胶质细胞,给予外源性NRG1(exogenous NRG1,HRG)观察HRG对离体培养的星形胶质细胞增殖和趋化的影响来研究HRG与星形胶质细胞激活的关系;进一步通过鞘内置入PE-10管给予雄性SD大鼠HRG观察HRG对大鼠基础疼痛阈值的影响以及NRG1-siRNA慢病毒预处理然后建立脊神经结扎(spinal nerve ligation,SNL)模型观察神经调节蛋白1(neuregulin1,NRG1)对雄性SD大鼠的行为学变化,检测脊髓水平星形胶质细胞的活化等2个体内实验来分析NRG1介导的星形胶质细胞活化在慢性神经病理性疼痛(Neuro pathic Pain,NPP)发生发展中的作用。
　　方法：
　　1.HRG对离体培养的星形胶质细胞增殖和趋化的影响:
　　取出生第三天的SD乳鼠双侧大脑皮层进行星形胶质细胞原代培养。待细胞长满后,37℃200rpm摇床20h纯化去除上面的小胶质细胞和成纤维细胞,并取纯度大于95％的星形胶质细胞用于后续实验。
　　1.1.HRG对离体培养的星形胶质细胞增殖的影响
　　1.1.1.不同剂量HRG对离体培养的星形胶质细胞增殖的影响
　　取24孔板传代培养的星形胶质细胞,密度为4×104cells/mL,随机分为5组(每组设3个副孔,n=3),分别给予生理盐水(NormalSaline,NS)或HRG,使HRG终浓度分别为:HRG0nM,HRG1nM,HRG5nM,HRG10nM,HRG20nM。将24孔板放入细胞培养箱,细胞生长至第三天达对数生长期时加入EdU(1:2000,培养基稀释),采用EdU掺入的方法检测HRG对体外培养的星形胶质细胞增殖的影响。
　　1.1.2.HRG对离体培养的星形胶质细胞增殖影响的受体途径分析
　　取经上述方法培养纯化的星形胶质细胞传代种在24孔板,密度为4×104cells/mL,随机分为4组(每组设3个副孔,n=3),分别给予NS、HRG或HRG+受体拮抗剂。药物浓度最终分别为:NS2μL/mL,HRG10nM,HRG10nM+AG147810μM,HRG10nM+AG87910μM。细胞生长至第三天达对数生长期时加入EdU(1:2000,培养基稀释),采用EdU掺入的方法检测体外培养的星形胶质细胞增殖。
　　1.2.HRG对离体培养的星形胶质细胞趋化的影响
　　1.2.1.不同剂量HRG对离体培养的星形胶质细胞趋化的影响
　　取上述培养纯化的星形胶质细胞随机分为5组(每组设3个副孔,n=3),采用transwell的方法分析HRG对体外培养的星形胶质细胞趋化能力的影响。Transwell每孔上室加入细胞悬液100μL(4000cells/100μL),下室加600μL不含FBS的F12培养基和药物,HRG终浓度分别为:HRG0nM,HRG1nM,HRG5nM,HRG10nM,HRG20nM。将transwell放入细胞培养箱(37℃、5%CO2、100%湿度),6h后取出transwell,擦掉膜上方的细胞,染DAPI,显微镜下观察计数膜下方的细胞数,即为趋化到膜下方的星形胶质细胞数。
　　1.2.2.HRG对离体培养的星形胶质细胞趋化影响的受体途径分析
　　取上述纯化的星形胶质细胞随机分为4组(每组设3个复孔,n=3),采用transwell的方法分析HRG对体外培养的星形胶质细胞趋化能力的影响。Transwell每孔上室加入细胞悬液100μL(4000cells/100μL),下室加600μL不含FBS的F12培养基和药物,药物浓度最终分别为:NS2μL/mL,HRG10nM,HRG10nM+AG147810μM,HRG10nM+AG87910μM。将transwell放入细胞培养箱(37℃、5%CO2、100%湿度),6h后取出transwell,擦掉膜上方的细胞,染DAPI,显微镜下观察计数膜下方的细胞数,即为趋化到膜下方的星形胶质细胞数。
　　2.NRG1对慢性神经病理性疼痛发生发展的影响
　　2.1HRG对大鼠基础痛阈的影响
　　32只雄性SD大鼠随机分为4组(n=8):生理盐水(20μL)对照组,HRG(10ng)组,HRG(10ng)+AG1478(10μg)组,HRG(10ng)+AG879(10μg)组。大鼠经枕骨大孔鞘内置入PE-10,使其头端到达脊髓腰膨大位置。利多卡因实验证实鞘内置管成功后,根据分组分别给予上述药物。每天给药前测定大鼠疼痛行为学变化(机械痛阈和热痛阈)。给药第14天,大鼠麻醉后,用4%多聚甲醛心脏灌注后取大鼠脊髓腰膨大组织做冰冻切片免疫荧光染色,观察大鼠脊髓背角星形胶质细胞的活化。
　　2.2.慢病毒特异下调体内NRG1对慢性神经病理性疼痛发生发展的影响
　　32只雄性SD大鼠随机分为4组(n=8):Sham组、Sham+慢病毒(107TU)组、SNL组、SNL+慢病毒(107TU)组。大鼠经枕骨大孔鞘内置入PE-10,使其头端到达脊髓腰膨大位置。利多卡因实验证实鞘内置管成功后,根据分组分别给予上述病毒。一周后,建立SNL模型。SNL术后隔天测定大鼠疼痛行为学变化(机械痛域和热痛域),SNL后第14天,麻醉大鼠,用4%多聚甲醛心脏灌注后取大鼠脊髓腰膨大组织做冰冻切片免疫荧光染色,观察大鼠脊髓背角星形胶质细胞的活化。
　　结果：
　　1.①体外培养的星形胶质细胞给予HRG后,HRG组与对照组相比,星形胶质细胞增殖明显增加(P<0.05)。在给予NRG1受体拮抗剂后,拮抗剂组与HRG组相比,增殖细胞数量明显减少(P<0.05),与对照组相比,增殖细胞数量减少约50%(P<0.05)。这些结果说明,NRG1可以剂量依赖性促进离体培养的星形胶质细胞的增殖,这种效应可能是通过ErbB2/4受体发挥作用。②transwell中离体培养的星形胶质细胞给予HRG后,HRG组与对照组相比,趋化至膜下方的星形胶质细胞明显增多(P<0.05)。在给予NRG1的受体拮抗剂后,拮抗剂组与HRG组相比,趋化至膜下方的星形胶质细胞明显减少(P<0.05),与HRG组相比,趋化至膜下方的星形胶质细胞减少约2/3。以上结果说明,NRG1可以剂量依赖性促进离体培养的星形胶质细胞的趋化,这种效应可能也是通过ErbB2/4受体发挥作用的。
　　2.①雄性SD大鼠脊髓水平给予HRG后,大鼠出现慢性神经病理性疼痛样的行为学变化,与生理盐水对照组相比,大鼠机械痛阈和热痛阈下降(P<0.05),并且脊髓腰膨大组织免疫荧光结果显示脊髓背角中星形胶质细胞激活。而给予HRG的同时给予其受体拮抗剂可抑制上述效应,HRG+AG1478组或HRG+AG879组与HRG组相比,大鼠的机械痛阈和热痛阈值升高(P<0.05);给药第14天脊髓腰膨大组织免疫荧光结果显示HRG+AG1478组和HRG+AG879组与HRG组相比,星形胶质细胞活化受到抑制。这说明NRG1在脊髓水平是一种致痛因子,并且可能通过激活星形胶质细胞上ErbB2/4受体发挥作用。②慢病毒特异性下调脊髓水平NRG1表达可延迟SNL术后大鼠的机械痛阈和热痛阈下降,脊髓水平星形胶质细胞激活。SNL术后同一时间点,SNL慢病毒组与SNL对照病毒组相比,大鼠的机械痛阈和热痛阈上调(P<0.05);脊髓腰膨大组织免疫荧光结果显示SNL术后第14天SNL慢病毒组与SNL对照病毒组相比,脊髓背角中星形胶质细胞的激活受到抑制。这提示NRG1在SNL模型后痛阈下降中发挥重要作用,可能通过激活脊髓背角中星形胶质细胞上的ErbB受体介导星形胶质细胞活化从而影响慢性NPP的发生发展。
　　结论：
　　①体外培养的星形胶质细胞表面表达有ErbB受体,HRG可通过激活星形胶质细胞上的ErbB受体剂量依赖性促进体外培养的星形胶质细胞的增殖和趋化。这为进一步研究NRG1导致慢性神经病理性疼痛发生发展过程中星形胶质细胞的活化奠定了理论基础。②证实并阐述了NRG1与慢性神经病理性疼痛发生发展过程中星形胶质细胞激活的密切关系。③SNL慢性神经病理性疼痛模型后,大鼠机械痛阈和热痛阈下降,星形胶质细胞激活,而慢病毒下调脊髓水平NRG1表达则可以延迟SNL术后大鼠机械痛阈和热痛阈值下降和星形胶质细胞的激活,说明NRG1介导的星形胶质细胞活化在慢性神经病理性疼痛发生发展中发挥关键作用。

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主 要 缩 略 词 表

中文摘要

英文摘要

前言

参考文献

第一部分神经调节蛋白1对离体培养的星形胶质细胞增殖和趋化的影响

材料与方法

1 主要仪器设备和试剂

2星形胶质细胞原代培养及纯化

3 免疫荧光双标法检测星形胶质细胞上表达ErbB受体的情况

4 HRG对离体培养的星形胶质细胞增殖的影响

5 HRG对离体培养的星形胶质细胞趋化的影响

6 EdU染色步骤

7 结果统计学分析

结果

1 离体培养的星形胶质细胞上表达ErbB受体

2 HRG对星形胶质细胞增殖的影响

3 HRG对星形胶质细胞趋化的影响

讨论

参考文献

第二部分神经调节蛋白1对神经病理性疼痛发生发展的影响

材料与方法

1 实验动物及分组

2 主要仪器和设备

3 主要试剂

4 方法和步骤

5 统计学分析

结果

1鞘内注射HRG对慢性神经病理性疼痛发生发展的影响

2 慢病毒下调NRG1对神经病理性痛的发生发展的影响

讨论

参考文献

综述1

参考文献

综述2

参考文献

附录

致谢