水通道蛋白-4敲除对小鼠海马依赖性学习记忆和突触传递长时程抑制的影响及机制

摘要

第一部分:水通道蛋白-4敲除对小鼠海马依赖性学习记忆和突触可塑性的影响
　　目的:在中枢神经系统,星形胶质细胞参与调节神经元的活性及功能,并在信号传导和处理、突触可塑性以及学习记忆等方面发挥重要的作用。水通道蛋白-4(aquaporins-4,AQ P-4)为水通道蛋白家族的一种,广泛分布在中枢神经系统,并主要表达于星形胶质细胞膜。AQ P-4在调节水稳态、细胞微环境以及脑体积等方面均发挥着重要的作用。此外,研究表明AQP-4也参与调节星形胶质细胞的功能。但是目前就AQ P-4是否参与调节海马区突触可塑性以及相关学习记忆的研究甚少。因此,本文以AQP-4基因敲除鼠(knockout,KO)为研究对象,探讨AQ P-4敲除对中枢神经系统中海马区的突触可塑性以及海马区依赖的学习记忆的影响及机制。
　　方法:采用急性离体脑片胞外场电位记录和脑片钳记录的方法分别记录AQ P-4野生型(wild type,WT)小鼠和KO小鼠海马区CA3-CA1通路的场兴奋性突触后电位(field excitatory postsynaptic potentials,fEPSPs)和兴奋性突触后电流(excitatory postsynaptic currents,EPSCs);采用新物体认知(novel object recognition,NOR)和条件恐惧记忆(fear conditioning)行为学实验观察AQ P-4敲除对小鼠海马区依赖的学习记忆以及相关情感记忆行为的影响。电生理结果采用双因素方差分析(ANOVA)结合Bonferroniposthoctest检验分析,行为学实验结果采用单因素方差分析(ANOVA)结合Student’stest检验分析方法。
　　结果:AQ P-4敲除损伤海马区依赖的新物体认知能力,在训练后90min和24h检测发现AQ P-4 KO鼠探索新物体时间显著减少,认知指数较AQ P-4WT鼠显著下降。此外,在条件恐惧行为学实验中,与WT鼠相比,KO鼠在恐惧记忆遗忘训练后24h、72h和120h时间点僵直率显著下降,但AQ P-4敲除不影响小鼠痛阈。AQ P-4敲除易化CA3-CA1通路的长时程抑制(long-term depression,LTD),但不影响其基础突触功能和传递;AQ P-4敲除引起的突触可塑性改变涉及突触后机制。AQ P-4敲除易化NMDA受体(N-methyl-D-aspartatereceptor,NMDAR)依赖的LTD(NMDAR-dependent LTD),不影响代谢性谷氨酸受体依赖的LTD(mGluR-dependent LTD)。此外,AQP-4敲除可选择性地增加NMDA受体介导的兴奋性突触后电流(EPSCs),不改变AMPA受体(α-mino-3-hydroxy-5-methylisoxazole-4-propionate receptor,AMPAR)介导的EPSCs幅度。
　　结论:AQP-4敲除损伤小鼠海马区依赖的新物体认知能力,促进恐惧记忆的消散,易化海马区CA3-CA1通路NMDA受体依赖的LTD。
　　第二部分:突触和突触外NMDA受体在水通道蛋白-4敲除所致小鼠学习记忆和突触可塑性改变中的作用
　　目的:突触可塑性是学习记忆的分子生物学基础,其主要表现形式是LTP和LTD。大量研究表明,LTP与学习记忆的获得和形成相关,而LTD与学习记忆的整合和遗忘相关。海马区NMDA受体是参与调节突触可塑性和学习记忆的核心分子,其不同亚型在调节突触可塑性和学习记忆过程中发挥着不同的作用。NMDA受体除了表达于突触后致密区(postsynaptic density,PSD),还分布于突触前膜以及PSD的周围或非突触膜上。其中位于突触外的NR2B-NMDA受体参与调节LTD的产生,而位于突触的NR2A-NMDA受体则参与调节LTP的诱发。因此,本实验研究突触和突触外NMDA受体在AQ P-4敲除所诱导的海马区依赖突触可塑性和学习记忆行为变化中的作用和机制。
　　方法:采用急性离体脑片胞外场电位记录和脑片钳记录的方法研究NR2A-NMDA受体和NR2B-NMDA受体对小鼠海马LTD的影响和机制,并采用新物体认知行为学实验和条件恐惧记忆行为学实验观察NR2A-NMDA受体和NR2B-NMDA受体在AQP-4敲除所导致的小鼠海马区依赖的学习记忆行为改变中的作用和机制。电生理结果采用双因素方差分析(ANOVA)结合Bonferroni post hoc test检验分析,行为学实验结果采用单因素方差分析(ANOVA)结合Student’s test检验分析方法。
　　结果:AQ P-4敲除易化LTD为NR2B-NMDA受体依赖的LTD,NR2B受体选择性阻断剂ifenprodil(3μM)和Ro256981(1μM)阻断AQP-4WT小鼠和KO小鼠LTD的诱发,NR2A受体选择性抑制剂PEAQX(0.4μM)无上述作用。突触外NR2B受体阻断剂HA966(500μM)拮抗AQP-4KO对LTD的易化作用。AQP-4KO选择性增加NR2B-NMDA受体介导的EPSCs。行为学实验发现,NR2B-NMDAR参与AQP-4KO所引起的新物体认知能力损伤,NR2A-NMDAR则无此作用。在遗忘训练前给予NR2B-NMDA受体阻断剂ifenprodil(3mg/kg)和突触外NR2B受体阻断剂HA966(2.5mg/kg)可拮抗AQP-4KO导致的恐惧记忆消散的易化,而给予NR2A受体阻断剂PEAQX(5mg/kg)对小鼠恐惧记忆的遗忘无影响。
　　结论:AQ P-4敲除通过增强突触外NMDA受体的功能,易化海马区CA3-CA1通路NMDA受体依赖的LTD,从而损伤小鼠新物体认知能力,促进恐惧记忆的消散。

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缩略词表

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前言

第一部分：水通道蛋白-4敲除对小鼠海马依赖性学习记忆和突触可塑性的影响

材料和方法

1. 实验动物

2. 实验主要药品与试剂

3. 主要仪器

4. 新物体认知实验

5. 条件恐惧实验

6. 离体细胞外场电位记录

7. 脑片膜片钳记录

8. 数据统计与分析

结果

1. 敲除水通道蛋白-4损伤小鼠海马区依赖的新物体认知能力

2. 水通道蛋白-4敲除促进小鼠恐惧记忆的消散

3. 水通道蛋白-4敲除不影响小鼠痛阈

4. 水通道蛋白-4敲除易化海马区CA3-CA1通路LTD

5. 水通道蛋白-4敲除不影响海马区基础突触传递

6. 水通道蛋白-4敲除易化NMDA受体依赖的LTD

7. 水通道蛋白-4敲除不影响代谢性谷氨酸受体依赖的LTD

8. 水通道-4敲除选择性增加海马区NMDA受体介导的EPSC

讨论

小结

第二部分：突触和突触外NMDA受体在水通道蛋白-4敲除所致小鼠学习记忆和突触可塑性改变中的作用

材料和方法

1.实验动物

2.实验主要药品与试剂

3. 主要仪器

4. 新物体认知实验

5. 条件恐惧实验

6. 离体胞外场电位记录

7. 全细胞膜片钳记录

8. 数据分析与统计

结果

1. 水通道-4 敲除选择性增加海马区 NR2B-NMDA 受体介导的EPSCs

2. 突触外 NR2B-NMDA 受体激活增加 AQP-4 KO 小鼠海马区NR2B-NMDA受体介导EPSC

3. NR2B-NMDA受体介导AQP-4敲除所致小鼠海马区LTD易化

4. 胞外谷氨酸浓度增加易化AQP-4 KO小鼠海马区LTD

5. 突触外NR2B-NMDA受体激活介导AQP-4 KO鼠海马区LTD的易化

6. p38 MAPK激活介导AQP-4敲除对小鼠海马区LTD的易化作用

7. NR2B-NMDA受体的激活介导AQP-4敲除对小鼠新物体认知能

8. 突触外NR2B-NMDA受体激活介导AQP-4敲除促进小鼠恐惧记

讨论

小结

全文总结

本文创新点

展望

参考文献

综述

攻读博士期间发表和待发表的文章

致谢