抑制KGFR表达对高氧暴露下A549细胞功能影响的研究

摘要

第一部分筛选KGFR沉默序列及对KGFR沉默A549细胞在高氧暴露下功能的初步研究
　　【目的】筛选有效的KGFR沉默序列,并研究高氧暴露下KGFR沉默的A549细胞的变化。
　　【方法】体外传代培养A549细胞,转染si-KGFR序列及si-NT序列,48h后收集细胞总RNA及总蛋白,使用实时荧光定量PCR法检测KGFRmRNA的表达;用Western blot法检测KGFR蛋白表达的水平。对有效序列细胞通以950ml/L高氧,对照组转染置于同一室内空气中,观察两组细胞形态变化,用MTT法检测细胞活性的变化。
　　【结果】①序列特异性si-KGFR可抑制KGFR的表达,si-KGFR-001、si-KGFR-002、si-KGFR-0033组KGFRmRNA表达均受到抑制,si-KGFR-002组抑制效率最高。
　　②与常氧对照组相比,si-KGFR-002转染细胞对高氧的耐受性降低,细胞形态不良,细胞活力降低(p<0.005)。
　　【结论】KGFR沉默下的A549细胞对高氧耐受性降低,表现为细胞形态不良与细胞活性降低。
　　第二部分高氧暴露下抑制KGFR表达对A549细胞的抗氧化功能的研究
　　【目的】研究抑制A549细胞KGFR表达后对高氧暴露A549细胞抗氧化性的影响,以及外源性给予α-硫辛酸(LA),角化上皮生长因子(KGF)后对细胞的影响。
　　【方法】体外传代培养人肺腺癌A549细胞,随机分为四组:
　　Ⅰ单纯高氧组;
　　Ⅱ高氧+si-KGFR组;
　　Ⅲ高氧+si-KGFR+LA组;
　　Ⅳ高氧+si-KGFR+KGF组。
　　各组通以950ml/L氧气,分别于培养24h、48h、72h后收集细胞,Western blot法检测各组KGFR蛋白表达的水平,采用流式细胞术检测各组A549细胞内活性氧水平及细胞凋亡水平;WST法检测细胞内锰型超氧化物歧化酶活性。
　　【结果】与高氧对照组相比：
　　①KGFR沉默细胞胞内ROS水平较单纯高氧细胞内ROS水平高(p<0.005)。
　　②外源性LA、KGF可以减轻KGFR沉默细胞内ROS的产生(p<0.05)。
　　③高氧暴露所致的A549细胞死亡以早期凋亡为主,而高氧暴露对KGFR沉默细胞的致死效应更为显著(p<0.005)。
　　④外源性LA、KGF可以部分减轻高氧暴露对KGFR沉默细胞的致死效应(p<0.005)。
　　⑤高氧暴露使KGFR沉默细胞锰型超氧化物歧化酶活性降低,但各组间酶活性变化无统计学意义。
　　⑥外源性LA、KGF可以提高高氧暴露下KGFR沉默细胞KGFR的表达(p<0.05)。
　　【结论】抑制KGFR表达可高氧暴露下A549细胞内ROS水平升高,细胞凋亡数量增加;外源性给予LA、KGF可部分减轻KGFR抑制所致效应。

目录

封面

声明

目录

中文摘要

英文摘要

前言

参考文献

第一部分 筛选KGFR沉默序列及对KGFR沉默A549细胞在高氧暴露下功能的初步研究

前言

材料与方法

结果

2.1转染序列的筛选

2.2 A549细胞形态学观察

讨论

参考文献

第二部分 高氧暴露下抑制KGFR表达对A549细胞的抗氧化功能的研究

前言

材料与方法

1.1 主要仪器

1.2 主要试剂

结果

1.3 MTT法检测LA对高氧下A549细胞活性的影响

1.4 MTT法检测KGF对高氧下A549细胞活性的影响

1.5 Western blot检测各处理组KGFR蛋白的表达

1.6 流式细胞仪检测各处理组对细胞内ROS的影响

1.7 各处理组A549细胞凋亡的影响

1.8 WST法检测各处理组A549细胞SOD酶活性

讨论

参考文献

综述

致谢