9-甲氧基喜树碱(MCPT)抗肿瘤作用及其机制研究

摘要

喜树碱(Camptothecin,CPT)由于高效、广谱的抗肿瘤活性而位居癌症治疗前列,但明显的毒副作用限制了它在临床上的使用,因而开发抗肿瘤活性强、毒副作用小的衍生物成为了国内外研究热点。9-甲氧基喜树碱(9-Methoxycamptothecin,MCPT),一种喜树碱衍生物,体内外试验均证实有明显的抗多种肿瘤活性,但对其有关细胞和分子方面的机制研究极少。本课题首先体外评价了9-甲氧基喜树碱的抗肿瘤细胞活性,并从9-甲氧基喜树碱诱导肿瘤细胞凋亡、影响DNA拓扑异构酶活性及其与DNA分子相互作用等三个方面进行了作用机制的研究。
　　1.评价9-甲氧基喜树碱体外抗肿瘤活性。结果表明,9-甲氧基喜树碱抑制7种肿瘤细胞系,呈剂量依赖性。其中,人卵巢癌细胞A2780和人宫颈癌细胞Hela对9-甲氧基喜树碱最为敏感,其IC50值分别为79±21nM和151±61nM,明显低于阳性对照药物10-羟基喜树碱(Hydroxycamptothecin,HCPT)。选取这两种细胞系开展后续作用机制研究。
　　2.研究了9-甲氧基喜树碱诱导细胞凋亡作用及其机制。结果表明:(1)9-甲氧基喜树碱处理A2780和Hela细胞后,荧光显微镜下观察到诱导的凋亡细胞,流式细胞仪检测到明显的早期和晚期凋亡细胞。9-甲氧基喜树碱诱导A2780细胞的早期凋亡和总凋亡率增加具有时间-剂量依赖性;(2)9-甲氧基喜树碱处理A2780和Hela细胞24h后即表现出强的G2/M期阻滞。1×IC50浓度的9-甲氧基喜树碱处理A2780细胞24h后对G2/M期阻滞最明显,达到81.93％;(3)9-甲氧基喜树碱能使A2780和Hela细胞中产生活性氧(ROS)明显增多。A2780细胞中ROS产生量最高达到对照组的5.22倍,Hela细胞中最高为2.65倍;(4)9-甲氧基喜树碱能不同程度激活caspase-3,-8和-9。在A2780细胞中对caspase-9酶激活程度最强,是对照组细胞的15倍。Hela细胞中caspase-3的酶活性被显著提高,约为对照组细胞的8倍;(5)实时定量PCR检测到9-甲氧基喜树碱调节了17个内、外源性细胞凋亡通路及细胞周期相关基因。其中对细胞周期调控基因p21,p27和cyclinE上调较显著;且明显上调参与外源性细胞凋亡通路的TNFα、Fas和FasL;同时还调节了主要参与内源性细胞凋亡通路的bcl-2家族有关基因表达水平;(6)Westernblot检测到TNFα,Fas,P53和P27的蛋白表达水平上调,与其基因水平调节一致。综上所述,9-甲氧基喜树碱可通过调节细胞周期调控蛋白使细胞周期阻滞于G2/M期,并增加ROS的产生、调节bcl-2家族相关基因激活caspase-9,从而启动内源性细胞凋亡通路;同时激活了caspase-8启动以TNFα和Fas/FasL为主的外源性细胞凋亡通路。以上两条通路共同激活caspase-3,最终导致A2780和Hela细胞凋亡。
　　3.研究了9-甲氧基喜树碱对DNA拓扑异构酶Ⅰ和Ⅱ活性的影响。结果显示,100μM的9-甲氧基喜树碱表现出对拓扑异构酶Ⅰ明显的抑制作用,与阳性对照药物喜树碱一样,可使超螺旋DNA产生明显的缺刻型DNA条带。不同浓度的9-甲氧基喜树碱均未表现出对拓扑异构酶Ⅱ的抑制作用(与阳性对照药物依托泊苷相比)。值得注意的是,100μM的9-甲氧基喜树碱能单独作用于超螺旋DNA并产生明显的缺刻型DNA产物,表明9-甲氧基喜树碱在没有拓扑异构酶Ⅰ存在的情况下也能作用于DNA。提示,9-甲氧基喜树碱的这种直接结合DNA的能力很有可能是其抗肿瘤活性强的一种重要机制。
　　4.采用光谱法研究了9-甲氧基喜树碱与DNA分子相互作用。结果表明,(1)紫外-可见吸收光谱显示,随着不断滴加CT-DNA,9-甲氧基喜树碱最大吸收峰出现了增色效应,谱带未发生偏移,表明其与DNA的作用属于外部键合模式(沟槽作用和/或静电作用)。9-甲氧基喜树碱处理CT-DNA前后体系的解链温度(meltingtemperature,Tm)值升高不明显,也支持外部键合模式;(2)荧光光谱显示,随着CT-DNA浓度不断增加,9-甲氧基喜树碱荧光强度不断增强,没有发生明显光谱偏移现象,支持外部键合模式;(3)9-甲氧基喜树碱与CT-DNA相互作用的圆二色谱显示,9-甲氧基喜树碱加入后,体系的正峰有小的提升,而其负峰有较明显的回落并伴有轻微的吸收峰红移现象。由于负峰变化程度大于正峰,表明两者结合以沟槽模式为主。综上可知,9-甲氧基喜树碱与CT-DNA的结合方式以沟槽模式为主。
　　综合以上研究结果表明,9-甲氧基喜树碱具有明显的抗多种肿瘤细胞活性,其作用机制主要是通过与拓扑异构酶Ⅰ-DNA形成三元复合物“路障”阻止DNA复制、以沟槽方式结合DNA并对其进行剪切、诱导肿瘤细胞凋亡而起到抗肿瘤作用。

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1 引 言

1.1 喜树碱简介

1.2 喜树碱及其衍生物抗肿瘤作用机制研究进展

1.3 本文研究意义及主要内容

2 9-甲氧基喜树碱对多种肿瘤细胞系体外增殖活性的影响

2.1 材料

2.2 方法

2.3 结果与讨论

2.4 本章小结

3 9-甲氧基喜树碱诱导A2780和He La细胞凋亡及其机制研究

3.1 材料

3.2 方法

3.3 结果与讨论

3.4 本章小结

4 9-甲氧基喜树碱对D NA拓扑异构酶Ⅰ和Ⅱ活性的影响

4.1 材料

4.2 方法

4.3 结果与讨论

4.4 本章小结

5 9-甲氧基喜树碱与D NA分子相互作用研究

5.1 材料

5.2 方法

5.3 结果与讨论

5.4 本章小结

6 总结与展望

6.1 总结

6.2 创新点

6.3 展望

致谢

参考文献

附录1 攻读博士学位期间发表的论文

附录2 英文缩写词表（按字母顺序排列）