MsrB1(SelR)对过氧亚硝酸根诱发人晶状体上皮细胞损伤的保护作用

摘要

白内障特别是老年性白内障是人类致盲的主要眼疾,严重影响人的生活质量。据推测,如能使白内障的发生推迟10年,白内障的手术会下降45％。因此,开展白内障发病机理和预防研究是一个十分重要的课题。
　　白内障的致病因子很多,病理复杂,但都与氧化应激导致晶状体的损伤相关。过氧亚硝酸根(ONOO)作为一个强的生物氧化剂和硝化剂,与各种生物大分子反应,引起脂质过氧化、DNA损伤和蛋白质氧化硝化,可能是白内障发病机制的一个重要方面。一些证据表明必需微量元素硒对眼起重要的保健作用,其中,硒蛋白R(SelR)也称蛋氨酸亚砜还原酶(Msr)B1在维持眼晶状体透明中的作用,受到人们的关注。然而,MsrB1对ONOO诱发晶状体上皮细胞损伤的保护作用,特别是其对晶状体细胞分化中信号通路分子损伤的保护作用鲜见报道。
　　本论文以人晶状体上皮(hLE)细胞SRA01/04为研究对象,探讨了MsrB1对hLE细胞的保护作用及其可能的机理,主要结果如下:
　　(1)MsrB1对ONOO诱导hLE细胞凋亡的抑制作用。
　　采用实时荧光定量PCR、MTT法、蛋白质印迹、荧光显微镜、透射电镜、流式细胞术等方法研究了MsrB1对ONOO诱导的hLE细胞凋亡以及氧化还原平衡的调节。结果表明低浓度的ONOO可以刺激hLE细胞增殖,而高浓度的ONOO明显导致hLE细胞死亡的增加。单独的ONOO处理或MsrB1基因沉默都可以诱导hLE细胞中氧化应激和内质网应激的发生,激活caspase-3,从而导致细胞凋亡。当MsrB1基因沉默细胞经300μMONOO处理后,使氧化应激水平、DNA断裂水平、内质网应激程度以及caspase-3活性进一步增加,从而加剧了hLE细胞的凋亡和死亡。以上研究结果表明,MsrB1在抑制ONOO导致的氧化应激,调节细胞内的氧化还原平衡和缓解内质网应激中起着重要的作用,且MsrB1也可以通过抑制caspase-3的激活和DNA的氧化损伤保护hLE细胞抵抗由ONOO诱导的细胞凋亡的发生。我们的结果提示MsrB1正常活性的丢失可能有助于白内障的发生。
　　(2)MsrB1对ONOO诱导hLE细胞F-actin损伤的保护作用。
　　F-actin是细胞骨架的重要组成部分,在基本的细胞分裂、迁移和分化等过程中起着至关重要的作用。采用蛋白质印迹、免疫沉淀、信号通路抑制剂处理以及免疫荧光等方法研究了MsrB1对ONOO诱导hLE细胞中F-actin损伤的保护作用。结果表明低浓度的ONOO?可以促进F-actin的组装,而高浓度的ONOO会损害F-actin的组装,与此同时,伴随着ERK1/2激活和ERK1/2抑制。高浓度的ONOO?作用于MsrB1基因沉默的细胞加剧了细胞中F-actin的去组装和ERK的失活,进一步的研究显示F-actin的去组装伴随着F-actin蛋白硝化水平的增加,bFGF是通过MEK依赖性途径激活ERK1/2的磷酸化,而ONOO是通过MEK非依赖性途径激活的ERK1/2磷酸化。以上结果表明MsrB1可能通过抑制ONOO对F-actin蛋白的硝化和ERK的失活,保护hLE细胞避免ONOO诱导的F-actin的损伤,提示MsrB1活性的丢失可能会对晶状体细胞的增殖和分化造成影响。
　　(3)MsrB1对BCS诱导的hLE细胞氧化应激的调节。
　　采用MTT法、Cu/Zn-SOD试剂盒、荧光分光光度计、荧光显微镜和蛋白质印迹等方法研究了MsrB1对铜离子螯合剂BCS诱导的hLE细胞凋亡和氧化应激的影响。结果表明1000μMBCS处理细胞后,Cu/Zn-SOD活性显著下降,伴随着hLE细胞内活性氧的累积,导致细胞凋亡和死亡的发生。单独的MsrB1基因沉默会诱导hLE细胞ROS水平的显著增加,从而激活细胞的保护机制,诱导Cu/Zn-SOD活性增加。而BCS作用于MsrB1基因沉默的细胞,则进一步增加胞内ROS水平以及细胞凋亡和死亡。蛋白质印迹检测结果表明,BCS作用于MsrB1基因沉默细胞,诱导的细胞凋亡增加与ERK磷酸化水平的下降有关,这可能与BCS导致SOD的活性下降,O2·得不到及时的清除,使得ONOO的生成增加有关,导致ERK的硝化抑制了它的磷酸化;此外,对蛋白质硝化的检测结果也证实了ONOO的产生。这些结果表明MsrB1可能通过直接或间接的清除活性氧而调节ERK的硝化和磷酸化,保护hLE细胞抵抗由BCS诱导的细胞凋亡的发生。

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目录

1 绪论

1.1引言

1.2白内障及其发病机理

1.3过氧亚硝酸根与疾病

1.4蛋氨酸亚砜还原酶

1.5问题的提出和研究内容

2 MsrB1对ONOO?诱导hLE细胞凋亡的抑制作用

2.1 引言

2.2 材料与方法

2.3 结果

2.4 讨论

2.5 本章小结

参考文献

3 MsrB1对ONOO?诱导hLE细胞F-actin损伤的保护作用

3.1 引言

3.2 材料与方法

3.3 结果

3.4 讨论

3.5 本章小结

参考文献

4 MsrB1对BCS诱导hLE细胞氧化应激的调节

4.1 引言

4.2 材料与方法

4.3 结果

4.4 讨论

4.5 本章小结

参考文献

5 全文总结

5.1 主要研究结果

5.2 主要创新点

5.3 课题展望

致谢

附录Ⅰ 攻读博士学位期间完成的主要论文

附录Ⅱ 主要缩写词表（按字母顺序）