富血小板血浆及IGF-1对人脂肪来源干细胞体外成脂分化的影响及比较

摘要

本文主要从以下两个部分展开论述：
　　第一部分 人脂肪来源干细胞的分离、培养及鉴定
　　目的：探索人脂肪来源干细胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）的分离及体外培养方法，观察其体外增殖特点、表面标记特征及成脂成骨分化能力。
　　方法：取20-30岁成年健康女性吸脂手术中抽吸脂肪组织，Ⅰ型胶原酶消化法获取人原代ADSCs，贴壁法培养、传代，并测定生长曲线。流式细胞术检测第3代人脂肪干细胞表面标记（CD11b/c、CD29、CD45、CD90）。取第3代人脂肪干细胞进行成脂诱导，油红O染色法鉴定成脂分化情况。取第3代人ADSCs进行成骨诱导，并用茜素红染色法鉴定成骨分化情况。
　　结果：采用Ⅰ型胶原酶消化人脂肪组织、过滤、离心、贴壁法分离纯化后得到的ADSCs纯度较高，生长曲线呈S形，细胞呈长梭形或多角形，在体外可快速稳定扩增。流式细胞仪检测CD45、CD11b/c表达呈阴性，CD29、CD90表达呈阳性。第3代人脂肪干细胞成脂诱导后，油红O染色可观察到细胞内有明显的脂滴形成；成骨诱导完成后，茜素红染色可见细胞内有明显的钙化结节形成。
　　结论：用吸脂手术中吸取的脂肪，经I型胶原酶消化并分离纯化可以得到纯度较高的ADSCs，体外可稳定迅速增殖及传代。人脂肪干细胞表达特定的表面标记、具备多向分化潜能，符合间充质干细胞的特征。
　　第二部分 富血小板血浆（PRP）和胰岛素样生长因子1（IGF-1）对人ADSCs体外成脂分化的影响及比较。
　　目的：探讨人富血小板血浆（PRP）的分离提取方法，观察PRP及IGF-1对体外培养人脂肪来源干细胞成脂分化的影响，观察两者对ADSCs成脂分化的作用差异，并初步探讨作用机制，为PRP应用于临床脂肪移植提供实验依据。
　　方法：1.用血常规检验管抽取每位志愿者30ml全血，混合均匀置于冰上。用2次离心法获取PRP。至检验科检验全血及PRP血小板含量。2.用IGF-1及二次离心法提取的人PRP对人ADSCs进行培养，实验分为对照组、PRP组、IGF-1组，每组三个复孔。各组成脂诱导9天后，进行油红O染色，甘油封片，正置相差显微镜400倍下拍照，每张片子随机5个视野。用IPP软件对各组脂滴个数、面积等进行分析比较。3.RT-PCR检测成脂诱导过程中PPAR-gamma表达量，分组为对照组、PRP组、IGF-1组。按照分组条件进行成脂诱导，4d后结束诱导，提取各组总RNA，逆转录为cDNA，再通过PCR进行扩增，电泳后，在紫外灯下观察比较目的基因条带。拍照后，用Image-J软件分析比较条带灰度值。
　　结果：通过二次离心的方法提取PRP，每30ml血液可获得PRP4ml，检验得PRP中血小板的含量为全血的8倍。成脂诱导9天后进行油红O染色，分析脂滴个数及面积发现，对照组脂滴个数及面积明显小于两实验组，而PRP组的各分析指标小于IGF-1组。RT-PCR结果显示：IGF-1组PPAR-gamma表达量最多，其次为PRP组，其次为对照组。
　　结论：二次离心法可以获得有效稳定且血小板含量较高的PRP。PRP及IGF-1对人ADSCs的成脂分化均有较强的促进作用，而IGF-1对其作用强于PRP。

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参考文献

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第一部分 大鼠脂肪来源干细胞的分离、体外培养及鉴定

前言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

第二部分 富血小板血浆（PRP）和胰岛素样生长因子1（IGF-1）对人ADSCs体外成脂分化的影响及比较

前言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

综述

参考文献

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