髓系白血病表达TREM-1及其微环境调控正常干/祖细胞TREM-1表达的研究

摘要

髓系触发受体（Triggering receptor expressed on myeloid cells，TREM）-1主要表达于中性粒细胞和单核细胞表面，能够触发和扩大感染性炎症反应。在细菌、真菌感染以及败血症、感染性休克情况下，TREM-1的表达显著上调，而在银屑病、溃疡性结肠炎、脉管炎等免疫性炎症的情况下，几乎检测不到TREM-1的表达。除了调节炎症反应，TREM-1还执行其他功能。最近有研究报道称：（1）非小细胞肺癌患者肿瘤相关巨噬细胞TREM-1受体表达异常，且表达水平与非小细胞肺癌的复发和预后相关；（2）TREM-1调控肝细胞癌癌肿周围Kupffer细胞活性，是Kupffer细胞活化以及肝癌发生的关键因素；（3）TREM-1表达水平与肝细胞癌癌细胞的恶性行为相关，对肝细胞癌的预后评估有重要价值；（4）TREM-1表达水平与粒细胞系和单核细胞系的发育相关。sTREM-1是TREM-1的可溶性成分，存在于体液中，被认为行使负性调节TREM-1受体信号功能。癌细胞所处微环境和细胞表面分子对白血病的发生发展有重要影响，推测TREM-1和sTREM-1可能参与髓系白血病机制，但目前尚无TREM-1和sTREM-1与髓系白血病相关的研究。
　　骨髓造血受微环境的严格调控以确保生成足量的成熟血细胞和免疫细胞，生成的细胞反馈影响造血环境，各种造血紊乱与微环境息息相关。当白血病发生时，白血病患者骨髓中健康的造血干细胞并不是像人们之前所认为的那样逐渐被消除，而是处于静息状态从而停止自我更新和分化。研究发现小鼠动物模型和患者的骨髓样品含有与正常对照样品一样甚至更多的正常造血干细胞，但是造血细胞的细胞周期调控因子和自我更新相关基因表达改变。我们推测白血病环境在基因转录水平调节造血细胞相关基因的表达并改变其行为，对白血病的发展产生影响。
　　因此，本文着力研究髓系白血病TREM-1和sTREM-1的表达情况，以及髓系白血病环境对正常造血细胞TREM-1表达水平的影响，以期揭示TREM-1与髓系白血病的关系，为随后TREM-1在白血病的功能和机制研究做铺垫，从以下几个方面进行论述。
　　第一部分 TREM-1在髓系白血病表达的研究
　　目的：
　　本部分旨在探索不同髓系白血病患者、达到完全缓解的慢粒患者和健康志愿者这几个群体TREM-1和sTREM-1的表达情况，为后续实验研究白血病微环境对正常造血细胞TREM-1表达水平的影响奠定基础。
　　方法：
　　于2012年11月-2013年10月期间在武汉协和医院血液科共收集77例患者的骨髓和外周血标本，其中包括35例首诊急性髓系白血病、25例首诊慢性粒细胞白血病、17例慢粒已达到完全缓解。白血病和完全缓解的诊断均以FAB分型、免疫分型以及细胞遗传学联合诊断为依据。另外还收集了13例健康的骨髓捐献者的骨髓和外周血标本。EDTA-K2抗凝，流式细胞术筛选CD45+CD34+细胞群并采集细胞表面TREM-1的荧光强度值分析其表达情况。ELISA检测骨髓上清、血浆sTREM-1的表达水平。
　　结果：
　　（1）细胞表面TREM-1的表达水平：与正常人相比，急性髓系白血病患者和慢性粒细胞白血病患者的CD34+细胞群细胞表面TREM-1表达水平均显著降低，但急性髓系白血病患者与慢性粒细胞白血病患者CD34+细胞群的TREM-1表达水平无显著差异。髓系白血病细胞系K562、HL-60、THP-1细胞也低表达TREM-1。（2）骨髓上清和血浆sTREM-1的表达水平：与正常人相比，急性髓系白血病患者和慢性粒细胞白血病患者的骨髓上清和血浆sTREM-1的表达水平均显著升高，但急性髓系白血病患者和慢性粒细胞白血病患者 sTREM-1的表达水平无显著差异，且骨髓上清和血浆sTREM-1的表达水平也无显著差异。（3）完全缓解的慢粒患者CD34+细胞群TREM-1受体表达水平以及骨髓上清和血浆sTREM-1的表达水平均与正常人无显著差异。
　　结论：
　　在国际上率先发现髓系白血病CD34+细胞TREM-1受体表达降低，其微环境中sTREM-1水平升高，而完全缓解患者的TREM-1和sTREM-1和正常人无显著差异，提示TREM-1可能参与髓系白血病病理机制。
　　第二部分白血病微环境调节造血干/祖细胞TREM-1表达的研究
　　目的：
　　本研究旨在探索白血病微环境是否影响造血细胞 TREM-1表达，进一步证实TREM-1参与白血病病理机制，从而证实TREM-1是白血病环境和白血病病理之间的纽带。
　　方法：
　　（1）收集脐带血，分离单个核细胞，进而分离 CD34+细胞；（2）培养白血病细胞系K562、THP-1、HL-60，收集培养上清，将上清和添加了10％ FBS的IMDM培养基1:1混匀，用混匀的培养基培养CD34+细胞，分别于不同的时间收集并离心分离CD34+细胞，流式细胞术检测CD34+细胞亚群表面TREM-1表达水平；（3）分别培养不同细胞浓度水平的K562、THP-1、HL-60细胞，收集上清，将上清和添加了10％FBS的IMDM培养基1:1混匀，用混匀的培养基培养CD34+细胞，收集细胞，流式细胞术检测CD34+细胞亚群表面TREM-1表达水平。
　　结果：
　　（1）0h CD34+CD38-细胞TREM-1的MFI比值的平均值是6.74±0.88；CD34+CD38+细胞TREM-1的MFI比值的平均值是8.04±1.28。CD34+CD38-细胞TREM-1的表达水平略低于CD34+CD38+细胞。（2）24小时后CD34+CD38-细胞TREM-1的MFI比值的平均值从6.74±0.88降到2.78±0.64；CD34+CD38+细胞TREM-1的MFI比值的平均值从8.04±1.28降到3.05±0.17。同时我们观察到24小时与48小时的TREM-1表达水平无显著差异，提示造血干细胞和祖细胞的TREM-1表达水平在24小时趋于稳定。用THP-1、HL-60的培养基上清或者白血病患者血浆、骨髓上清和含10％胎牛血清的IMDM的1:1混合物37℃培养CD34+细胞48小时得到的结果相同。（3）我们还继续探讨了白血病环境对正常造血细胞 TREM-1表达水平的影响与白血病细胞数的相关性。结果显示，培养于不同K562细胞浓度的培养基上清中的造血细胞TREM-1的表达水平随细胞浓度的降低而升高，CD34+CD38-细胞TREM-1的MFI比值的平均值从2.17±0.30依次上升到5.40±1.15；CD34+CD38+细胞TREM-1的MFI比值的平均值从3.08±0.58依次上升到7.51±0.25。用不同THP-1和HL-60细胞浓度的培养基上清与含10％胎牛血清的IMDM的1:1混合物培养CD34+细胞24小时也得到相同结果。
　　结论：
　　（1）正常造血干细胞TREM-1表达水平低于祖细胞；（2）髓系白血病微环境可下调正常造血干细胞和祖细胞 TREM-1表达，且这种调节作用呈白血病细胞数依赖性。

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中文摘要

英文摘要

第一部分 髓系白血病TREM-1表达的研究

1 前言

2 研究对象、材料和方法

3 结果

4 讨论

第二部分 白血病微环境调节造血干/祖细胞TREM-1表达的研究

1 前言

2 材料和方法

3 结果

4 讨论

结论

致谢

参考文献

综述 微环境对白血病发生发展的影响

攻读硕士学位期间发表的学术论文