非酒精性脂肪性肝病合并病毒性肝炎小鼠模型的建立及其免疫学损伤机制的研究

摘要

背景及目的:
　　非酒精性脂肪性肝病（Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD）是代谢综合征在肝脏的表现，包括单纯性脂肪肝（simple steatosis），非酒精性脂肪性肝炎（Non-alcoholic steatohepatitis，NASH），以及NASH相关的肝纤维化/肝硬化、肝癌。随着生活水平的提高，NAFLD在发展中国家的发病率显著上升，我国NAFLD患者数量在过去的10年增加了近一倍，部分地区的发病率已达四分之一。同时，我国是病毒性肝炎感染的高发地区，约有1亿HBV感染者及4000万HCV感染者，其中合并NAFLD的患者有逐年增加的趋势，这一部分人群已经引起了研究者们的注意。
　　目前关于NAFLD合并病毒性肝炎的研究多集中在NAFLD合并慢性丙型肝炎(Chronic hepatitis C,CHC)：NAFLD可以增加CHC患者进展为肝硬化和原发性肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)的风险，并降低抗病毒治疗的疗效。但是，丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)本身具有致肝细胞脂肪变的作用，因此在NAFLD合并CHC患者中得到的结论可能并不能推而广之。关于NAFLD对慢性乙型肝炎(Chronic hepatitis B,CHB)的影响，目前的研究结果却并不一致，与CHC中看到的现象也不相同。部分研究认为，肝脏脂肪变对CHB具有保护作用：在脂肪肝患者中，乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)载量更低，乙肝病毒表面抗原(Hepatitis B surface antigen,HBsAg)清除率更高。但另一方面，一些研究显示，脂肪肝可能会增加CHB患者发展为肝硬化及HCC的风险，降低恩替卡韦抗病毒治疗的效果。还有一些研究认为，脂肪肝对HBV病毒载量及干扰素抗病毒治疗无影响。事实上，这方面的研究存在许多难点，可能是导致这些矛盾结论的原因。首先，研究中多用肝脏超声诊断脂肪肝。肝脏超声检查仅能检出肝内脂肪沉积超过30％的中度脂肪肝，难以检出轻度脂肪肝（肝脏内脂肪沉积为5％-30％），因此在分组时，可能将轻度脂肪肝患者作为无脂肪肝的对照。其次，在研究NAFLD合并CHB时，难以保证受试者在代谢、病毒、治疗等多种因素上的一致性。第三，人群研究难以获取肝组织观察肝内免疫、代谢等方面的改变。因此，NAFLD在慢性病毒性肝炎中的影响仍不明确。
　　动物模型可以克服上述临床研究中的不足，但目前尚缺乏NAFLD合并病毒性肝炎的动物模型。为了更好的研究NAFLD对慢性病毒性肝炎的影响，本研究的具体研究目标如下：
　　1.成功建立饮食诱导的NAFLD合并病毒性肝炎小鼠模型；
　　2.在饮食诱导的NAFLD合并病毒性肝炎小鼠模型中，动态观察肝炎病毒的复制情况及肝组织损伤程度；
　　3.探讨NAFLD影响病毒性肝炎病程的相关免疫学机制。
　　方法:
　　1.采用60％高脂饮食（High fatty diet,HFD）喂养C3H/HeN小鼠12周，观察小鼠一般状态及生活习性改变，观察体重、谷丙转氨酶(Alanine aminotransferase,ALT)、谷草转氨酶（Aspartate aminotransferase,AST）、甘油三酯(Triglyceride,TG)、总胆固醇(Total cholesterol,TC)、高密度脂蛋白(High density lipoprotein,HDL)、低密度脂蛋白（Low density lipoprotein,LDL)、血糖（Glucose,GLU）、胰岛素水平及稳态模型胰岛素抵抗指数（Homeostasis Model Assessment-Insulin Resistance,HOMA-IR）的动态变化及肝脏组织学变化。
　　2.3型鼠肝炎病毒（Murine hepatitis virus-3,MHV-3）腹腔注射感染NAFLD小鼠，观察小鼠一般状态及生存率；动态观察小鼠感染后血清生化学变化及肝脏病理改变；逆转录酶-聚合酶链反应（Reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR）检测小鼠肝内MHV-3。
　　3. MHV-3腹腔感染NAFLD小鼠及正常饮食（Normal diet, ND）小鼠，比较两组小鼠生存率；比较两组小鼠各时间点血清生化学变化及肝组织病理改变；实时定量聚合酶链反应(Real-time polymerase chain reaction,Real-time PCR)检测并比较各时间点两组小鼠肝内MHV-3复制情况。
　　4.流式细胞术检测MHV-3感染后各时间点小鼠肝内CD3+CD8+CD69+T细胞、CD3+CD8+PD-1+T细胞、CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞比例的变化，并比较两组小鼠之间的差异；Real-time PCR检测并比较两组小鼠MHV-3感染后各时间点肝内IL-1β、IL-6、IL-10、IL-17A、IL-22、IL-33、TNF-α、Fgl2的表达，并比较两组小鼠之间的差异。
　　结果:
　　1.成功建立NAFLD小鼠模型。HFD饮食喂养12周，C3H/HeN小鼠体型肥胖，皮毛油腻，不喜活动，体重明显增加；外周血ALT及AST水平无显著升高；TG、TC、HDL、LDL、GLU、胰岛素水平及HOMA-IR均显著升高；小鼠肝脏体积增大，肝重高于ND组，边缘圆钝，色泽红黄，表面光滑，有油腻感；肝组织切片HE染色及油红O染色可见肝细胞内大量脂滴形成。
　　2.成功建立饮食诱导的NAFLD合并病毒性肝炎小鼠模型。NAFLD小鼠感染MHV-3病毒后，在3-12天内出现死亡，死亡率约为20％；感染小鼠外周血ALT和AST水平显著升高；感染小鼠肝脏苍白，缺乏光泽，并可见弥漫分布的针尖样出血点；HE染色除可见肝细胞内脂滴形成，还可见肝细胞胞浆疏松、肝细胞坏死、淋巴细胞浸润等表现；PCR可检测到肝内MHV-3病毒复制。
　　3.NAFLD小鼠感染MHV-3病毒后，生存率与对照组无差异；MHV-3病毒复制高于对照组，于感染4天时有统计学差异（P=0.002）；ALT及AST升高幅度大于ND组；肝组织炎症坏死程度交对照组严重。
　　4.NAFLD小鼠感染MHV-3病毒后，肝内IL-1β、IL-6、IL-10、IL-17A、IL-33、TNF-α、Fgl2表达水平上调，且上调幅度大于ND组小鼠，而IL-22表达水平降低，且降低幅度大于对照组小鼠。
　　5.NAFLD小鼠感染MHV-3病毒后，肝内CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞比例降低，但感染第16天开始高于ND组小鼠；CD3+CD8+CD69+T及CD3+CD8+PD1+T细胞均出现升高，上升幅度大于ND组小鼠，且细胞比例回落后仍持续高于ND组小鼠。
　　结论:
　　1.本研究采用HFD喂养C3H/HeN小鼠12周成功建立NAFLD小鼠模型，并在此基础上采用MHV-3病毒腹腔感染小鼠，成功建立NAFLD合并病毒性肝炎小鼠模型。为研究NAFLD对病毒性肝炎的影响提供了动物模型，开辟了新的研究途径。
　　2.NAFLD可以加剧肝内MHV-3病毒复制，加重肝内炎症反应。
　　3.NAFLD在病毒性肝炎感染早期可以促进肝内细胞因子的释放，使CD3+CD8+CD69+T比例增加，CD4+CD25+Foxp3+Treg比例降低，可导致肝内炎症坏死加重的。而感染后期CD4+CD25+Foxp3+Treg及CD3+CD8+PD1+T细胞比例的增加，有可能阻碍病毒清除。

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中文摘要

英文摘要

第一部分 非酒精性脂肪性肝病合并病毒性肝炎小鼠模型的建立

前言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

第二部分 非酒精性脂肪性肝病合并病毒性肝炎小鼠模型中病毒复制和肝损伤的动态观察

前言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

第三部分 非酒精性脂肪性肝病合并病毒性肝炎小鼠模型中病毒复制增强及肝损伤加重的免疫学机制研究

前言

材料和方法

结果

讨论

参考文献

全文小结

综述

参考文献

英文缩略语对照表

附录

致谢