调节性和效应性T细胞在胆道闭锁小鼠免疫炎症发展中的作用及影响

摘要

目的：研究调节性T细胞（Treg）和效应性Th17细胞（Th17）在胆道闭锁（BA）小鼠免疫炎症发展中的作用；并过继输注Treg细胞或注射IL-17中和抗体，进一步明确Treg/Th17细胞在胆道闭锁免疫学发病机制中的作用。
　　方法：利用RRV建立胆道闭锁小鼠模型，新生Balb/c小鼠随机分为以下四组：1，正常组：出生后24h内腹腔注射生理盐水；2，轮状病毒组：出生后24h内腹腔注射RRV；3，Treg细胞组：出生后12h内腹腔过继输注Treg细胞，随后12h内注射RRV；4，IL-17抗体组：出生后12h内注射RRV，随后连续两天注射不同剂量（15μg，30μg，50μg）IL-17中和抗体。观察各组小鼠在不同时期的表型及组织病理学等变化；利用实时定量PCR（RT-qPCR）和Western blot分别检测各组小鼠肝脏组织中Foxp3，IL-17A以及ROR-γt基因和蛋白表达；利用免疫组织化学检测各组小鼠肝脏组织中CD4+细胞、Foxp3+Treg细胞及IL-17+Th17细胞表达部位及变化；流式细胞术检测各组小鼠肝脏组织中Treg细胞及Th17细胞比例变化。利用ELISA检测小鼠肝脏组织中炎性细胞因子变化，以及肝脏组织DC细胞的TLRs表达情况。分离DC细胞、CD4+T细胞并进行培养，利用ELISA检测细胞培养上清中IL-6表达区别。体外利用细胞共培养，观察 Treg细胞对Th17细胞分化的抑制作用，观察胆道闭锁小鼠体内Treg细胞抑制功能的变化。
　　结果：正常组23只，3天内死亡1只，无1例出现发育迟缓和胆汁淤积症状，其余小鼠均健康存活到21天。24只轮状病毒组小鼠中发生胆道闭锁的有18只（75.0％），以发育迟缓（体重增长缓慢或停滞）和胆汁淤积（无毛区皮肤黄染，大便陶土样）为主要症状；肝脏大体观见淤胆明显，表面颗粒状，肝外胆管呈索条状，胆囊显示不清；肝脏及胆管组织切片HE染色可见肝外胆管闭锁，汇管区大量炎性细胞浸润。胆道闭锁小鼠肝脏组织中Foxp3，IL-17和ROR-γt基因及蛋白表达均明显高于正常组，在第7天达到峰值；免疫组织化学显示胆道闭锁小鼠肝脏组织尤其是汇管区中CD4+细胞、Foxp3+Treg细胞及IL-17+Th17细胞均显著增加；流式细胞术发现胆道闭锁小鼠肝脏组织中Treg细胞比例降低，而Th17细胞比例升高；胆道闭锁小鼠肝脏组织中IL-2、IL-4、IL-5、TGF-β1、IL-10，IL-17，IL-12、IL-23、IFN-γ和IL-6均高于正常对照组。胆道闭锁小鼠肝脏DC细胞中TLR3、7、8基因和蛋白均高于正常对照组。胆道闭锁小鼠肝脏DC细胞中IL-6明显高于正常对照组，而CD4+T细胞中IL-6分泌无明显差异。细胞共培养发现Treg细胞能抑制Th17细胞产生，而胆道闭锁小鼠中Treg细胞抑制功能降低。过继输注Treg细胞后，小鼠胆道闭锁发生率降低到23.1％，肝脏炎性表现明显减轻，小鼠生存期延长，肝脏组织中Th17细胞相关基因和蛋白较胆道闭锁小鼠明显降低，免疫组织化学检测发现IL-17+细胞表达减少，流式细胞术发现肝脏组织中Th17细胞比例降低（P<0.05）；注射不同剂量IL-17中和抗体后，小鼠胆道闭锁发生率均有不同程度降低，以注射50μg抗体组有统计学意义（P<0.05），而且肝脏组织尤其是汇管区炎性表现减轻，伴随有小鼠生存期延长，进一步研究发现注射50μg IL-17抗体组的小鼠肝脏组织中IL-17+蛋白较病毒组明显减少（P<0.05），而免疫组化发现肝脏组织汇管区IL-17+细胞表达较病毒组明显减少（P<0.05）。
　　结论：1.病毒感染后，引起肝脏微环境改变以及TLRs依赖的DC细胞等变化，进而导致小鼠体内Treg细胞减少及功能降低，而Th17细胞增多，二者失衡在胆道闭锁胆管损伤的进行性炎症中发挥着重要作用。
　　2.过继输注Treg细胞后能明显改善小鼠胆道闭锁表型，延长生存期，减轻体内炎症表现，表明Treg细胞对病毒感染后的炎性反应起抑制作用，为胆道闭锁的防治提出了可能。
　　3.通过注射IL-17中和抗体，可以达到使小鼠胆道闭锁表型降低，生存期延长的目的，减轻体内炎症表现，表明Th17细胞对胆道闭锁的发病过程起促进作用，为治疗病毒感染后胆道闭锁的进行性免疫炎症奠定了实验基础。

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参考文献

资助基金

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英文摘要

第一部分 调节性T细胞和效应性Th17细胞在胆道闭锁小鼠中的表达及机制研究

材料和方法

结果

讨论

参考文献

第二部分 过继输注Treg细胞对小鼠胆道闭锁表型及生存时间的影响

材料和方法

结果

讨论

参考文献

第三部分 应用IL-17中和抗体抑制Th17细胞效应对胆道闭锁表型及生存时间等的影响

材料和方法

结果

讨论

参考文献

全文小结

综述

参考文献

致谢

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