连环素p120调控NF-κB活化在气道炎症反应中的作用及其分子机制

摘要

本文主要从以下几个方面展开论述：
　　第一部分 脂多糖诱导的气道炎症反应中连环素p120对NF-κB信号通路的影响
　　目的:本实验采用脂多糖（LPS）刺激体外培养的人气道上皮细胞建立气道上皮炎症反应模型，检测连环素p120（简称p120）蛋白的表达变化、NF-κB信号通路的活化及其下游靶基因IL-8的表达变化，初步探讨人体气道炎症发生的分子机制。
　　方法:根据MTT结果及本实验室前期研究，选取20μg/ml LPS作为致炎因子处理培养的人气道上皮细胞；运用免疫荧光、细胞核浆分离提取蛋白及Western blot技术检测刺激前后p120、抑制蛋白IκBα及NF-κB亚基p65蛋白表达的改变及p65是否发生核内转位；运用ELISA和荧光实时定量PCR技术分别检测IL-8表达量的改变；运用瞬时转染及特异性siRNA技术以增强或敲低细胞中p120的表达，进一步验证p120与NF-κB信号通路之间的关系。
　　结果:Ⅰ．Western blot、荧光实时定量PCR及免疫荧光染色证实p120存在于人气道上皮细胞中，而且，与对照组比较，LPS刺激后p120蛋白表达下调。
　　Ⅱ．细胞核浆分离提蛋白及Western blot技术检测发现LPS刺激人气道上皮细胞后，NF-κB信号通路活化——NF-κB p65总蛋白表达增多，而且转位入核，其抑制蛋白IκBα表达逐渐减少。同时，荧光实时定量PCR和ELISA显示NF-κB下游的靶基因IL-8的表达量较未给予LPS刺激的对照组明显增多，差异具有显著性。
　　Ⅲ．外源性高表达p120及siRNA技术使细胞中p120低表达后，进一步验证p120与NF-κB信号通路之间的关系。实验结果表明，外源性p120过表达后，NF-κB p65总蛋白量几乎无改变，p65未发生核转位，IL-8的表达水平变化不大。然而，LPS刺激后，过表达组IL-8表达较对照组明显降低（P<0.001）。p120敲低后NF-κB信号通路显著活化——NF-κB p65总蛋白表达增多，p65转位入核， IL-8表达水平增加（P<0.001）。进一步证明LPS诱导的气道炎症反应中，p120可能通过负性调控NF-κB信号通路抑制炎症反应。
　　结论:LPS诱导的气道炎症反应中，p120蛋白表达下调，NF-κB信号通路活化；过表达p120可抑制NF-κB信号通路，敲低p120后NF-κB信号通路显著活化。LPS刺激可能通过下调p120进而活化NF-κB信号通路引起气道上皮的炎症反应。
　　第二部分 气道炎症中p120调控的NF-κB活化部分依赖RhoGTP酶家族蛋白RhoA
　　目的:本实验通过LPS刺激及机械划伤建立体外培养的人气道上皮细胞炎症反应模型，检测RhoGTP酶家族蛋白RhoA活性变化及其与p120、NF-κB之间的关系，探讨气道炎症中p120调控NF-κB信号通路活化的可能分子机制。
　　方法:运用免疫共沉淀及Western blot方法检测刺激前后RhoA总蛋白表达改变及其与p120的结合情况；运用G-LISA方法检测RhoA活性变化；采用RhoA下游ROCK抑制剂Y26732抑制RhoA活性后，通过细胞核浆分离提取蛋白及Western blot检测NF-κB的活性变化；使用瞬时转染外源性p120质粒及特异性siRNA技术干预p120表达，进一步观测气道上皮细胞中RhoA活性变化及其与p120、NF-κB之间的关系。
　　结果:Ⅰ．免疫共沉淀结果首次显示气道上皮细胞中RhoA与p120相互作用并存在于同一复合物中。
　　Ⅱ．LPS刺激和机械划伤方法处理气道上皮细胞后，Western blot及免疫共沉淀结果显示 RhoA总蛋白以及与p120结合的RhoA蛋白改变不明显，但G-LISA检测发现RhoA活性显著上升。
　　Ⅲ．运用抑制剂Y27632抑制RhoA活性后，细胞核浆分离提取蛋白及Western blot结果显示气道炎症反应中NF-κB p65亚基的入核被部分抑制。
　　Ⅳ．p120过表达后，与对照组相比，尽管RhoA活性无变化，但LPS刺激后，p120过表达组RhoA活性明显下降（P<0.001）；同样，机械划伤刺激后，p120 N过表达组RhoA活性明显下降（P<0.05），同时，IL-8表达下调。
　　Ⅴ．siRNA敲低p120后，RhoA总蛋白无变化，与p120结合的RhoA随着p120表达缺失而无法检测。G-LISA检测发现RhoA活性显著上升，LPS刺激和机械划伤后，RhoA活性升高更为显著（P<0.001及P<0.05）。同时，机械划伤后IL-8表达增加，差异具有显著性。
　　结论:Ⅰ．气道上皮细胞中，RhoA与p120存在于同一复合物中。气道炎症反应中，虽然RhoA总蛋白以及和p120结合的RhoA蛋白无变化，但RhoA活化。
　　Ⅱ．抑制剂Y27632抑制RhoA活性后，NF-κB活化被部分抑制。
　　Ⅲ．p120过表达不活化RhoA，但p120敲低后RhoA活性显著上升，伴随NF-κB p65亚基转位入核及IL-8表达水平增加。
　　经推测，气道炎症反应中p120可能部分通过RhoA实现对NF-κB信号通路的调控。

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主要缩略词表

中文摘要

英文摘要

第一部分脂多糖诱导气道炎症反应中连环素p120对NF-κB信号通路的影响

前言

材料和方法

结果

讨论

参 考 文 献

第二部分气道炎症中p120调控的NF-κB活化部分依赖RhoGTP酶家族蛋白RhoA

前言

材料和方法

结果

讨论

小结

参 考 文 献

综述一

综述二

附录

致谢