连环素p120在香烟烟雾诱导的气道炎症反应中的作用及其分子机制

摘要

第一部分p120活化NF-κB信号通路在香烟烟雾诱导的气道上皮细胞炎症反应中的作用
　　一、目的：
　　通过香烟烟雾提取物（CSE）刺激人气道上皮细胞建立气道炎症反应的体外模型，检测连环素p120（p120）表达变化及其对NF-κB信号通路的影响，初步探讨香烟烟雾所致气道炎症的分子机制。
　　二、方法：
　　根据本实验室经验及相关文献制备100％CSE溶液，采用MTT检测不同浓度CSE（1%，5%，10%，15%，20%，30%，40%，50%）对细胞活力的影响。根据MTT结果，选用15%CSE作用不同时间，采用Western blot检测p120、IκBα及p-IκBα蛋白的表达变化，并采用Real-time PCR检测p120 mRNA水平；运用免疫荧光、核浆分离提取蛋白技术检测NF-κB p65蛋白表达及分布的改变；采用ELISA和Real-time PCR检测IL-8蛋白及mRNA表达水平的改变。采用瞬时转染特异性p120 siRNA敲低上皮细胞中p120的表达或采用脂质体瞬时转染p1201A和3A质粒，观察CSE刺激下p120表达水平变化对NF-κB信号通路的影响。
　　三、结果：
　　1．MTT结果显示15%CSE刺激24 h后气道上皮细胞仍保持80%的活力，但20%CSE作用后细胞活力降至40%。 Western blot检测发现p120主要以亚型3存在于人气道上皮细胞，其表达下调呈浓度和时间依赖性。Real-time PCR结果显示p120 mRNA含量也一致性减少。
　　2．15%CSE刺激人气道上皮细胞后，Western blot检测显示IκBα表达减少而p-IκBα水平增加；细胞核浆分离提蛋白后Western blot检测发现NF-κB p65蛋白胞质表达减少，而核内表达增加；免疫荧光染色也证实NF-κB p65发生核转位。同时，Real-time PCR和ELISA检测发现前炎症因子IL-8（NF-κB信号下游的靶基因）蛋白及mRNA的表达随刺激时间的延长显著增加。
　　3．采用siRNA沉默p120在气道上皮细胞中的表达后给予15%CSE刺激，虽然 NF-κB总蛋白含量没有变化，但其在 Ser536位点的磷酸化显著增加，与Scramble组比较，差异具有显著性（P<0.05）。ELISA检测发现 IL-8、IL-1β及IL-6的表达水平较Scramble组也显著增加（P<0.001）。
　　4.转染 p1201A和3A质粒入气道上皮细胞后给予15%CSE刺激，虽然NF-κB总蛋白没有改变，但其在Ser536位点的磷酸化相对于MT组显著降低，差异具有显著性（P<0.05）。同时，ELISA检测发现IL-8、IL-1β及IL-6的表达水平较MT组显著减少（P<0.001）。
　　四、结论：
　　在CSE诱导的气道炎症反应中，p120可能通过NF-κB信号通路发挥调控炎症反应的作用。
　　第二部分气道炎症反应中p120活化NF-κB信号通路的可能机制
　　一、目的：
　　通过检测CSE刺激后RhoA/ROCK的活性和蛋白水平变化以及另一种粘附连接蛋白E-cadherin的表达变化，进一步探讨气道炎症反应中p120活化NF-κB信号通路的可能分子机制。
　　二、方法：
　　首先采用CSE刺激复制气道上皮细胞炎症反应模型，然后加入ROCK抑制剂Y27632抑制RhoA/ROCK信号，瞬时转染特异性p120 siRNA沉默p120或p1203A质粒外源性过表达 p120，并转染不能结合 RhoA的 p120突变质粒（p120DRDD-GFP）及不能结合E-cadherin的p120突变质粒（p120DEcad-GFP），采用Western blot检测p120、E-cadherin、NF-κB p65、RhoA及ROCK1的蛋白表达；免疫共沉淀技术检测p120与RhoA结合情况；免疫荧光和ELISA技术检测NF-κB p65的定位和Ser536位点的磷酸化情况；G-LISA技术检测RhoA活性的变化。
　　三、结果：
　　1．15%CSE刺激后，Western blot结果显示虽然RhoA总蛋白没有变化，但是下游蛋白ROCK1的表达增加；粘附连接蛋白E-cadherin的表达减少。
　　2．免疫共沉淀结果发现气道上皮细胞中p120与RhoA存在于同一复合物中。15%CSE作用下，虽然与p120结合的RhoA蛋白改变不明显，但G-LISA检测显示RhoA活性显著上升。
　　3．siRNA沉默p120后，在15%CSE刺激后气道上皮细胞内虽然RhoA总蛋白无变化，但ROCK1的表达增加。G-LISA检测也显示RhoA的活性显著上升，与Scramble组比较，差异显著（P<0.05）。过表达p1203A后，在15%CSE刺激后气道上皮细胞内的RhoA和ROCK1的表达都减少。G-LISA检测也显示，相对于MT组RhoA活性显著降低。
　　4．采用Y27632抑制RhoA/RCOK1信号通路后，免疫荧光发现NF-κB p65的入核被部分抑制；ELISA技术检测发现NF-κB p65(Ser536)的磷酸化也减少。
　　5.转染 p120DRDD-GFP质粒后，发现即使在15%CSE刺激下，RhoA和ROCK1的表达都无明显变化；NF-κB p65（Ser536）的磷酸化和RhoA活性也没有变化。而转染p120DEcad-GFP质粒后，虽然NF-κB p65的表达没有变化，但RhoA的表达减少，NF-κB p65（Ser536）的磷酸化减少，RhoA活性也降低。
　　四、结论：
　　1．人气道上皮中，p120可以与RhoA结合，CSE刺激可以激活RhoA/ROCK信号。
　　2.沉默p120可增强CSE诱导的RhoA/ROCK信号的活化，而过表达p1203A可部分抑制CSE诱导的RhoA/ROCK信号的激活。
　　3．抑制剂Y27632抑制RhoA/ROCK信号通路后，CSE诱导的NF-κB活化被部分抑制。
　　4. p120不能与RhoA结合后，不能活化NF-κB信号通路；而不能与E-cadherin结合后，活化NF-κB信号通路不受影响。
　　由此可见，气道炎症反应中p120可能通过RhoA/ROCK活化NF-κB信号通路，而且不依赖E-cadherin。

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第一部分p120活化NF-κB信号通路在香烟烟雾诱导的气道上皮细胞炎症反应中的作用

前言

材料和方法

结果

讨论

参 考 文 献

第二部分气道炎症中p120活化NF-κB信号通路的可能机制

前言

材料和方法

结果

讨论

参 考 文 献

综述:p120连环蛋白在固有免疫和炎症中作用的研究进展

附录

致谢