3-oxo-C12-HSL介导的UPR在脂多糖引起的炎症中的作用及NGAL和铁调素对肝硬化细菌移位的诊断价值

摘要

本文主要从以下几个部分展开论述：
　　第一部分 3-oxo-C12-HSL介导的非折叠蛋白反应在脂多糖引起的炎症中的作用
　　目的：3-氧十二烷酰高丝氨酸内酯（3-oxo-C12-HSL）是一种由铜绿假单胞菌产生的群体感应分子。它不仅能调控细菌毒力因子的表达，同时也可以通过直接阻断核因子κB（NF-κB）信号传导及诱导细胞凋亡而调节宿主免疫反应。最新的研究显示3-oxo-C12-HSL能诱导主动脉内皮细胞产生非折叠蛋白反应，而且非折叠蛋白反应在后期可通过阻断NF-κB信号通路来抑制炎症反应。因此，3-oxo-C12-HSL也有可能通过激活非折叠蛋白反应而抑制NF-κB活化进而抑制炎症反应。尽管如此，目前关于这一可能的抑制机制知之甚少。因此，研究了3-oxo-C12-HSL对小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞的细胞活力的影响，并进一步研究了其是否能激活非折叠蛋白反应及是否抑制脂多糖诱导的NF-κB的活化。
　　材料和方法：分别用0μM，6.25μM，12.5μM，25μM，50μM，100μM的3-oxo-C12-HSL培养RAW264.7细胞12小时；分别用0μM，6.25μM，100μM的3-oxo-C12-HSL作用于RAW264.7细胞0小时，1小时，3小时，6小时，12小时，24小时；然后用WST-1法和流式细胞术检测这些细胞的活性及细胞凋亡率。在一个合适的浓度作用了适当的时间后，抽提RAW264.7细胞RNA，用逆转录聚合酶链式反应和实时定量聚合酶链式反应测定非折叠蛋白反应信号通路上的基因mRNA的表达情况，用Western blot法测定这些基因的蛋白表达模式。用酶联免疫吸附测定法测定3-oxo-C12-HSL对脂多糖诱导的细胞因子合成的影响。
　　结果：6.25μM的3-oxo-C12-HSL不影响RAW264.7细胞的细胞活性。用6.25μM的3-oxo-C12-HSL预处理RAW264.7细胞能够有效激活非折叠蛋白反应并促进非折叠蛋白反应的靶基因如CCAAT增强子结合蛋白β（C/EBPβ）和CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白（CHOP）的表达。C/EBPβ和CHOP的表达和脂多糖诱导的NF-κB活化呈负相关，且3-Oxo-C12-HSL预处理也能抑制脂多糖诱导的细胞因子的合成。
　　结论：发现3-oxo-C12-HSL预处理RAW264.7细胞能够在不影响细胞活性的前提下有效激活非折叠蛋白反应，且这一非折叠蛋白反应能够抑制脂多糖介导的前炎症因子的产生及NF-κB的活化。这有可能是铜绿假单胞菌逃避机体免疫系统进而维持持续性感染的另一机制。
　　第二部分 NGAL和铁调素对大鼠肝硬化细菌移位的诊断价值
　　目的：自发性细菌性腹膜炎（SBP）是肝硬化患者最常见的并发症，细菌移位（BT）是SBP发生的关键机制。由于需要进行手术移除肠系膜淋巴结，细菌移位在人体上的研究受到了明显的限制。酰基高丝氨酸内酯是参与革兰氏阴性菌群体感应的信号分子，如上研究所示，其也参与调节机体的炎症反应。中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（NGAL）主要由中性粒细胞等合成和释放。腹水中的NGAL能够有效诊断细菌性腹膜炎。铁调素是肝细胞、巨噬细胞等合成并释放，血中的铁调素能够诊断低出生体重婴儿细菌感染引起的迟发型败血症。NGAL和铁调素有可能作为诊断晚期肝硬化细菌移位的生物标记物使用。在本研究中，分析了酰基高丝氨酸内酯作为细菌移位标记物的可能性；检测了大鼠肝硬化模型的血清与腹水中NGAL和铁调素与细菌移位和肠系膜淋巴结中存在细菌DNA的关系；同时也检测了血清NGAL和铁调素能否鉴别细菌移位和肠系膜淋巴结中仅存在细菌DNA，腹水中的NGAL和铁调素能否鉴别自发性细菌性腹膜炎及能否诊断腹水中存在细菌DNA。
　　材料和方法：四氯化碳诱导SD大鼠出现肝硬化腹水，用胰酪胨大豆琼脂平板进行肠系膜淋巴结及腹水细菌培养，用ABIPRISM310自动测序仪对肠系膜淋巴结及腹水中的细菌DNA进行测序，并用ELISA法测定血清和腹水中的NGAL和铁调素。用ROC曲线评价NGAL和铁调素在诊断细菌移位及肠系膜淋巴结腹水中存在细菌DNA的价值。
　　结果：5只大鼠作为对照；55只大鼠用来建立模型，在此过程中27只大鼠死亡，28只出现肝硬化腹水。在这28只大鼠中6只发现肠系膜淋巴结细菌培养阳性，7只发现肠系膜淋巴结细菌DNA阳性而细菌培养阴性，15只肠系膜淋巴结细菌培养及细菌DNA检测均阴性。腹水中培养出的细菌和肠系膜淋巴结中培养出的细菌序列高度一致。在诊断细菌移位时血清NGAL和铁调素的曲线下面积分别为0.910，0.858，两者联合的曲线下面积为0.940，在两者均检测阳性时诊断细菌移位的敏感性和特异性分别为0.667，0.963。在诊断肠系膜淋巴结中存在细菌DNA时，血清NGAL和铁调素的曲线下面积分别为0.906，0.779，两者联合的曲线下面积为0.950，两者均检测阳性时的敏感性和特异性分别为1.000，0.900。在所有肠系膜淋巴结发现有细菌DNA的大鼠中，NGAL和铁调素在鉴别其淋巴结中是否含有活细菌（细菌移位）时的曲线下面积分别为0.857，0.857，两者联合时曲线下面积为0.857，在两者均检测阳性时诊断细菌移位的敏感性和特异性分别为1.000，0.714。在诊断自发性细菌性腹膜炎时，腹水NGAL和铁调素的曲线下面积分别为0.879，0.883，两者联合的曲线下面积为0.977，在两者均检测阳性时的敏感性和特异性分别为1.000，0.955。在诊断腹水中存在细菌DNA时腹水中NGAL和铁调素的曲线下面积分别为0.795，0.804，两者联合的曲线下面积为0.956，在两者均检测阳性时的敏感性和特异性分别为0.889，0.947。腹水NGAL和铁调素鉴别出其腹水是否含有活细菌（自发性细菌性腹膜炎）时的曲线下面积分别为1.000，0.944；两者联合时曲线下面积为1.000，在两者均检测阳性时的敏感性和特异性分别为1.000，1.000。
　　结论：在本肝硬化大鼠模型中观察到了细菌移位，并在肠系膜淋巴结中观察到细菌培养阴性而细菌DNA阳性。酰基高丝氨酸内酯不适宜作为细菌移位的生物标记物使用。尽管样本量不大，初步证实血清中NGAL和铁调素在诊断细菌移位及肠系膜淋巴结存在细菌DNA时具有较高的准确性，联合应用这两个指标可以提高诊断的敏感性和特异性。腹水中的NGAL和铁调素在诊断自发性细菌性腹膜炎及腹水中存在细菌DNA时具有较高的准确性，联合应用这两个指标可以提高诊断的准确性。

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第一部分3-oxo-C12-HSL介导的UP R在脂多糖引起的炎症中的作用

前言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

第二部分NGA L和铁调素对大鼠肝硬化细菌移位的诊断价值

前言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

综 述 一

参考文献

综 述 二

参考文献

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