BCR-ABL1阳性微泡的生物学功能和临床检测意义

摘要

本文对BCR-ABL1阳性微泡的生物学特征及内容物进行分析。
　　目的：微泡(MV)是一种新型的细胞间信息交流载体，具有丰富的生物学功能；MV的生物学功能由其携带的内容物决定，不同应激条件下MV的内容物存在较大差异，是细胞的一种适应性机制。本部分研究拟以K562细胞为代表，了解慢性髓性白血病(CML)来源MV的生物学特性以及主要包含的内容物，明确其功能指向；同时探讨应激状态下K562细胞及其MV中miRNA表达谱等内容物的改变。
　　方法：体外培养K562细胞，采用梯度离心法收集MV；离心获得的沉淀物以透射电镜观察，流式细胞仪分析其大小和表面标志，同时采用PKH-26及CFSE等荧光染料染色沉淀物后于激光共聚焦和荧光显微镜下观察；经鉴定是MV后提取其中的RNA，实时定量PCR检测其中的BCR-ABL1表达，荧光原位杂交(FISH)检测其中的染色体片段；在此基础上，采用低血清培养刺激K562细胞并收集其来源的MV，以正常培养的K562细胞及其MV作为对照，芯片检测四个样本中的miRNA表达谱；对比分析不同状态下MV中miRNA表达谱的差异，生物信息学分析差异miRNA分子可能参与的生物学行为。最后，构建自主创新的小鼠骨质移植微小残留病(MRD)模型，实时定量PCR方法定期检测小鼠外周血细胞及MV中BCR-ABL1水平。
　　结果：我们采用梯度离心方法获取的沉淀物，经透射电镜、荧光显微镜、共聚焦显微镜观察发现为一种直径0.1-1.0μm的游离于细胞外的双层脂质小囊泡结构，携带有母体细胞的细胞器和部分细胞质，符合国内外文献对MV的定义。流式细胞仪检测发现，K562-MV大小均小于1.0μm，主要分布区间为0.3μm，0.5μm和0.8μm，表面表达大量的Annexin V分子。实时定量PCR证明K562-MV中可检出BCR-ABL1 mRNA，FISH结果发现MV中携带Ph染色体片段。利用K562细胞成功构建同种骨质移植小鼠MRD模型，肿瘤细胞在同种移植骨质中能够存活约10周；定期检测外周血细胞及MV中BCR-ABL1发现，基于细胞检测持续阴性时，MV中BCR-ABL1水平却逐渐升高，提示MV极有可能优先于细胞进入外周血。miRNA表达谱分析发现，饥饿应激后K562细胞中miR-1826、miR-1、miR-1979、miR-92b等分子水平下降，其作用靶点主要为VEGF、Wnt等通路，可能与维持自身存活信号相关；饥饿后的K562-MV中这部分miRNA分子表达水平升高，推测 K562细胞接受饥饿刺激后可能通过 MV外排大量miRNA降低自身表达水平，是细胞应对环境改变的适应性新机制。此外，K562-MV中高表达的部分miRNA（如miR-125b）具有显著的促癌效应，提示这部分MV可能具有恶性转化其他正常细胞的功能。
　　结论：我们在这部分研究中成功分离并鉴定了K562-MV并初步阐明了其中的内容物组成；应激条件下，MV可能是细胞通过非降解途径外排多种物质(尤其是miRNA分子)的关键介质；K562-MV中负载大量致癌性miRNA及BCR-ABL1 mRNA，可能具有恶性转化正常细胞的功能；此外，MV可能还是一种先于细胞出现在外周血循环的优秀检测指标。

目录

封面

声明

目录

英文缩略词表

中文摘要

英文摘要

第一部分 BCR-ABL1阳性微泡的生物学特征及内容物分析

前言

材料和方法

结果

讨论

参考文献

第二部分 BCR-ABL1阳性微泡恶性转化正常造血干/祖细胞

前言

材料和方法

结果

讨论

参考文献

第三部分 BCR-ABL1阳性微泡的临床检测意义

前言

材料和方法

结果

讨论

参考文献

附录

致谢