LSD1在前列腺癌雄激素非依赖性表型转化中的作用及机制研究

摘要

本文分两个部分进行探讨：
　　第一部分：过表达和干扰LSD1的慢病毒载体构建和鉴定
　　目的：构建和鉴定过表达和干扰LSD1慢病毒载体，为进一步的实验研究奠定基础。
　　方法：1.采用PCR技术从LSD1 cDNA克隆质粒中钓取LSD1基因，并将该基因克隆到慢病毒载体表达质粒GV166中，构建慢病毒载体表达质粒GV166-LSD1，通过PCR鉴定、测序比对目的基因LSD1，用GV166-LSD1转染293T细胞后Western Blot检测LSD1蛋白的表达，将GV166-LSD1质粒和包装质粒pHelper1.0、pHelper2.0共转染293T细胞，包装和生产携带LSD1基因的重组慢病毒LV-LSD1，测定病毒滴度。LV-LSD1感染LNCaP细胞后，Real-time定量PCR和Western Blot检测LSD1基因mRNA和蛋白的表达水平。2.LV-LSD1-感染LNCaP细胞后，通过puromycin抗性压力筛选过表达LSD1的单克隆稳定株LNCaP-LSD1细胞，定量PCR和Western Blot检测LNCaP-LSD1细胞LSD1基因mRNA和蛋白的表达水平。3.根据权威文献验证过的LSD1基因siRNA干扰靶点序列，构建shRNA慢病毒（Lentivirus,LV）表达质粒，并进行PCR鉴定和测序比对，将GV307-LSD1-shRNA质粒载体及包装质粒pHelper1.0、pHelper2.0共转染293T细胞，进行病毒包装成LV-LSD1-shRNA，并进行滴度测定；LV-LSD1-shRNA感染LNCaP-AI细胞后，Real-time定量PCR和Western Blot检测LSD1基因mRNA和蛋白的表达水平。
　　结果：1.成功构建过表达LSD1慢病毒载体LV-LSD1，病毒滴度为2.0E+8 TU/ml，LV-LSD1感染LNCaP细胞后，其LSD1 mRNA和蛋白的表达水平明显升高。2.筛选出过表达LSD1的单克隆稳定株LNCaP-LSD1细胞，其LSD1 mRNA和蛋白的表达水平升高。3.构建出干扰LSD1表达慢病毒载体LV-LSD1-shRNA，病毒滴度为5.0E+7 TU/ml，LV-LSD1-shRNA感染LNCaP-AI细胞后，其LSD1 mRNA和蛋白的表达显著降低。
　　结论：成功构建过表达LSD1慢病毒载体LV-LSD1；成功筛选获得过表达LSD1的单克隆稳定株LNCaP-LSD1细胞，并在mRNA和蛋白表达水平验证了LSD1过表达；成功构建干扰 LSD1的慢病毒载体LV-LSD1-shRNA，并在LNCaP-AI细胞产生了预期的干扰效应。上述成果为进一步研究LSD1在前列腺癌雄激素非依赖性表型转化中的作用及机制奠定实验基础。
　　第二部分：LSD1在前列腺癌雄激素非依赖性表型转化中的作用及可能机制
　　目的：探讨LSD1在前列腺癌雄激素非依赖性表型转化中的作用及可能机制。
　　方法：1.CCK-8法检测LNCaP-LSD1与LNCaP细胞在Bicalutamide处理后细胞增殖水平的差异，以及LSD1-siRNA、con-siRNA、Pargyline、Tranylcypromine处理后LNCaP和LNCaP-AI细胞的细胞活力的变化，以及以上处理联合R1881刺激后细胞数量的改变。2.定量PCR和Western blot检测LNCaP细胞和LNCaP-LSD1细胞AR mRNA和蛋白表达水平的差异；ELISA法检测LNCaP细胞与LNCaP-LSD1细胞在不同浓度Bicalutamide处理后PSA分泌水平的差异，并检测LSD1-siRNA、con-siRNA单独或与Bicalutamide联合处理后LNCaP-AI细胞PSA分泌水平的变化。3.FCM亚G1峰(sub G1)法检测Etoposide单独或与LSD1-siRNA、con-siRNA联合处理后LNCaP-AI细胞凋亡的差异；定量PCR和Western Blot检测LNCaP和LNCaP-LSD1细胞p53、p21和Bax mRNA和蛋白表达水平的差异，观察LSD1-siRNA处理后LNCaP-AI细胞p21和HDM2 mRNA和蛋白的变化；Western Blot检测Con-siRNA和LSD1-siRNA处理后LNCaP-AI细胞的Bax、PUMA和survivin蛋白表达水平的差异。
　　结果：1.LNCaP细胞在在去雄激素环境或 Bicalutamide阻断雄激素受体后增殖能力受到明显抑制，而LNCaP-LSD1细胞仍能持续增殖；LSD1-siRNA、Pargyline和Tranylcypromine处理后，LNCaP和LNCaP-AI细胞活力均明显降低；此外，LSD1-siRNA和Tranylcypromine抑制了R1881对LNCaP和LNCaP-AI细胞的促增殖效应。2.LNCaP细胞和LNCaP-LSD1细胞AR mRNA和蛋白表达水平的无明显差异；LNCaP-LSD1细胞PSA分泌水平显著高于LNCaP细胞，10μmol/L Bicalutamide显著降低LNCaP细胞PSA分泌水平，但对LNCaP-LSD1细胞PSA分泌水平无影响；Bicalutamide对LNCaP-AI细胞PSA分泌无影响，LSD1-siRNA处理使Bicalutamide重新获得了对LNCaP-AI细胞PSA分泌的抑制效应。3.LSD1-siRNA促进了Etoposide诱导的LNCaP-AI细胞凋亡，LNCaP-LSD1细胞p53 mRNA和蛋白表达量与 LNCaP细胞无明显差别，p21、Bax mRNA和蛋白表达量较LNCaP细胞明显减少；LSD1-siRNA增加了LNCaP-AI细胞p21和HDM2 mRNA表达水平，LSD1-siRNA上调了LNCaP-AI细胞p21、HDM2、Bax和PUMA蛋白表达，下调了survivin蛋白的表达。
　　结论：LSD1可能在前列腺癌AI转化中扮演了重要角色。前列腺癌在雄激素剥夺环境中上调LSD1基因表达，LSD1通过活化AR信号通路，抑制p53依赖性凋亡通路，从而诱导前列腺癌获得AI表型。

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第一部分 过表达和干扰LSD1的慢病毒载体构建和鉴定

引言

1． 材料

2．方法

3 结 果

4 讨论

5 结论

参考文献

第二部分 LSD1在前列腺癌雄激素非依赖性表型转化中的作用及可能机制

引言

1． 材料

2． 方法

3 结 果

4 讨论

5 结论

参考文献

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