环氧二十碳三烯酸在非酒精性脂肪性肝炎中的作用及其相关机制研究

摘要

研究背景及目的:
　　非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是一种常见的肝脏疾病，尤其在发达国家具有较高的患病率。其定义为无过量饮酒史(或酒精摄入量<20g/d)，以弥漫性肝细胞大泡性脂肪变性和脂质蓄积为特征的临床病理综合征。该病的整个病理过程包括单纯性脂肪肝、脂肪性肝炎、肝纤维化和肝硬化等四个阶段。非酒精性脂肪肝患者中约有20％～30％可发展为非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，其与单纯脂肪变性的区别主要在于肝细胞气球样变和炎症损伤的存在，并可能最终进展为肝硬化和肝细胞癌。目前有关非酒精性脂肪性肝炎形成的确切机制尚未完全明确，而普遍认可的是经典的“二次打击”学说。所谓的“第一次打击”是指外周和肝脏的胰岛素抵抗所导致的脂质,尤其是脂肪酸和甘油三酯在肝细胞中的蓄积,即脂肪变性。而“第二次打击”则是由氧化应激，脂质过氧化和大量的炎性因子（如TNF-α，IL-1和IL-6）等多种因素导致的炎症损伤。而其中TNF-α被认为是单纯性脂肪肝进展为脂肪性肝炎的主要细胞因子,可以通过1）与肝细胞膜上受体结合，活化Casepase-8，进而活化Casepase-3，直接导致肝细胞凋亡；2）抑制线粒体的呼吸功能并增加线粒体活性氧物质和过氧化脂质的形成，导致肝细胞膜的破坏和引起炎症反应。3）活化其他炎性细胞因子如IL-6、IL-8和某些粘附分子，形成放大炎症效应，诱发肝脏炎症。
　　研究表明，巨噬细胞在非酒精性脂肪肝的发病机制中发挥重要作用。经高脂饮食诱导的大鼠NASH模型中，肝脏枯否细胞大量活化，并且产生多种促炎因子以及ROS，导致肝细胞损伤。经胆碱蛋氨酸缺乏（MCD）饮食诱导的小鼠NASH模型中，肝脏内TNFα及MCP-1的mRNA表达水平明显增加,而后者是巨噬细胞活性的强效介质。NASH发病过程中巨噬细胞参与肝损伤的机制，一方面在于无法正确的识别及消除危险因素，另一方面又由于细胞毒性机制的过度动员，使得无法阻止炎症反应。另外，巨噬细胞暴露于游离脂肪酸后，也可通过与相应细胞表面受体及胞内信号的相互作用影响炎症反应.
　　环氧二十碳三烯酸（EET）是花生四烯酸（AA）第三条代谢通路中通过细胞色素P450表氧化酶催化底物花生四烯酸反应生成的代谢产物之一，是具有强大生物学活性的内生性脂质环氧化物。该表氧化酶途径可产生四种同分异构体，即5,6-EET，8,9-EET，11,12-EET和14,15-EET。但EETs在体内半衰期很短，由可溶性环氧化物水解酶（soluble epoxide hydrolyse，sEH）迅速降解为活性较低的二羟基-二十碳三烯酸（dihydroxyeicosatrienoic acids，DHETs），因此在体内很难研究这些脂环氧化物。而可溶性环氧化物水解酶抑制剂（soluble epoxide hydrolyse inhibitor，sEHI）可降低EETs的水解，提高体内EETs的水平。
　　目前已发现EETs具有多种生理功能，如扩张血管，降低血压，调节脂质代谢和胰岛素抵抗等。有多项研究通过应用sEH抑制剂，降低体内EETs的水解，显著降低了动物模型体内不同器官的炎症反应，从而证实了EET在不同疾病中均具有抗炎作用。Node等人发现在利用TNF-a,IL-1及LPS刺激内皮细胞时，EETs可通过抑制粘附分子（CAMs）的诱导而发挥抗炎作用。EETs还可通过抑制单核细胞合成前列腺素2缓解大鼠模型因注射LPS引起的发热。但EETs在非酒精性脂肪性肝炎中的作用及其机制还没有被证明。
　　本研究试图探讨EETs在MCD饮食诱导的小鼠脂肪性肝炎中的保护性作用及其相关机制。具体研究内容如下：
　　一、建立非酒精性脂肪性肝炎(NASH)小鼠模型，并用sEH抑制剂TPPU进行干预。
　　1.检测小鼠肝脏内EETs含量的变化；观察体重、肝重及肝指数的变化；检测肝功能(ALT/AST)，肝脏及外周血脂含量(TC/TG)；观察小鼠肝组织病理变化及肝细胞脂肪变性程度；研究EETs在NASH的发生发展中对肝脏脂肪变性以及炎性损伤所起到的干预作用。
　　2.检测外周血及肝脏内炎性因子（TNF-α、IL-1、IL-6）和趋化因子（MCP-1/CCL2、IL-8/CXCL8）水平的变化；检测肝脏内PPARα、ICAM-1、VCAM-1等炎性相关分子mRNA表达情况，及肝内NF-kB的表达和活化情况，探讨EETs在NASH病程中发挥干预作用的可能机制。
　　二、体外建立肝细胞与巨噬细胞共培养体系，通过游离脂肪酸刺激及EETs直接干预后，检测细胞上清炎性因子及趋化因子水平的变化，观察细胞形态及胞内脂滴大小等变化，探讨EETs是否通过抑制巨噬细胞的促炎作用，在NASH病程中发挥保护效应。
　　三、观察MCD组、MCS组及MCD+TPPU组小鼠肝脏组织中NF-κB总的表达情况。获取小鼠原代巨噬细胞，体外应用游离脂肪酸刺激及EETs干预后，检测巨噬细胞NF-κB入核活化的情况，探讨EETs通过抑制巨噬细胞炎性作用在NASH病程中发挥保护效应的具体机制。
　　研究方法:
　　1.通过喂食C57BL/6小鼠蛋氨酸胆碱缺乏（MCD）饮食6周，建立非酒精性脂肪性肝炎(NASH)小鼠模型，干预组中则将sEH抑制剂TPPU加入饲水中喂食小鼠。收集1w、2w、4w、5w、6w后模型组、干预组及对照组小鼠血清及肝组织标本。自动生化仪检测各时间点肝功能(ALT/AST)，肝脏及外周血脂含量(TC/TG)；ELISA技术检测肝脏内EETs含量的变化,外周血及肝脏炎性因子（TNF-α、IL-1、IL-6）和趋化因子（MCP-1、IL-8）的表达水平。应用HE染色观察小鼠肝脏组织病理损伤情况,油红染色观察肝细胞脂肪变性程度。Realtime-PCR方法测定肝脏内PPARα、ICAM-1、VCAM-1等炎性相关分子mRNA表达情况。免疫组化技术检测MCD饮食组、MCS饮食组及MCD+TPPU干预组小鼠肝脏组织中NF-κB的表达活化情况。
　　2.应用Transwell小室，体外建立HepG2细胞与THP-1细胞共培养体系，通过游离脂肪酸(油酸及棕榈酸)刺激及4种EET同分异构体分别干预后, ELISA检测刺激组、干预组及空白对照组细胞上清炎性因子及趋化因子水平的变化;油红染色观察HepG2细胞形态及胞内脂滴大小变化。
　　3.应用石蜡油腹腔注射，3天后收集小鼠腹腔原代巨噬细胞，游离脂肪酸刺激下培养巨噬细胞12小时，干预组分别加入四种EET同分异构体(5,6-EET,8,9-EET,11,12-EET,14,15-EET)进行干预后，激光免疫共聚焦观察细胞内 NF-κB活化情况；提取巨噬细胞核蛋白，试剂盒检测细胞核内NF-κB表达水平的变化。
　　结果:
　　1.MCD饮食喂养6周后，小鼠的体重和肝重均明显下降，肝脏内出现大量的脂肪沉积、肝细胞气球样变性及点状坏死，伴有炎性细胞的浸润。同时，肝功能（ALT，AST）明显升高，血浆内甘油三酯和胆固醇水平下降，而肝内甘油三酯水平显著升高。经TPPU干预后，小鼠肝脏内 EETs的含量显著增加，肝细胞损伤和炎性细胞浸润的情况得到明显改善，肝功能及肝内甘油三酯水平显著降低，但对血脂水平和肝细胞内脂肪沉积的无显著影响。
　　2.MCD饮食诱导后，肝脏及血清内促炎细胞因子（TNF-α，IL-1，IL-6）以及相关
　　3.趋化因子（IL-8，MCP-1）水平均有所升高，尤其是TNF-α，IL-1和MCP-1。而在TPPU干预组小鼠中，这些指标在不同时间点均有所下降。TPPU的干预还导致了炎症相关粘附分子（ICAM-1，VCAM-1）mRNA表达水平的下调，而与脂类代谢和抗炎密切相关的过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR-）的mRNA表达较 NASH组小鼠则有所升高。MCD组较MCS组小鼠肝脏组织中NF-κB的表达明显增强，而TPPU干预组小鼠肝脏组织中NF-κB的表达较MCD组明显减弱。
　　4.为了进一步探讨EETs是否能够减少游离脂肪酸（FFA）刺激所诱导的促炎性细胞因子的释放及肝细胞损害，在体外将EETs的四种同分异构体5,6–EET，8,9–EET，11,12-EET和14,15-EET–EET分别加入FFA刺激下的3种细胞体系中：1）HepG2细胞2）THP-1细胞3）HepG2和THP-1细胞共培养体系。经过24小时培养后，发现在HepG2和THP-1细胞共培养体系中11,12-EET能显著降低FFA刺激引起的TNF-α，MCP-1和IL-1β的释放。5,6-EET和8,9-EET也可一定程度抑制TNF-α和IL-1β的释放，但效果较弱，而14,15-EET几乎没有抑制作用。在游离脂肪酸的刺激下THP-1单独培养时，11,12-EET也对TNF-α和IL-1的释放具有抑制效果，但并没有在HepG2和THP-1细胞共培养体系中的作用显著。而在HepG2单独培养时并未观察到类似现象。
　　4.小鼠原代巨噬细胞在FFA刺激下培养，并分别加入四种EET同分异构体干预12小时后，激光共聚焦观察发现，FFA刺激后NF-κB入核明显增加，而11,12-EET的干预可抑制该现象。
　　结论:
　　1.EETs的水解抑制剂（TPPU）可增加小鼠体内EETs的含量，从而改善由MCD饮食诱导的脂肪性肝炎小鼠模型肝脏内炎症损伤、肝功能，降低肝内甘油三酯水平,但对肝细胞脂肪变性没有明显的影响。
　　2.TPPU干预可显著降低MCD饮食诱导的NASH小鼠模型肝脏及血清内促炎细胞因子以及相关趋化因子的水平；还导致了炎症相关粘附分子表达水平的下调，而同时上调了促进脂类代谢的分子PPAR-的表达。
　　3.在体外HepG2和THP-1细胞共培养体系中11,12- EET能显著降低FFA刺激诱导下THP-1细胞分泌的相关促炎因子，5,6-EET和8,9-EET有类似作用，但效果较弱，而14,15- EET的抑制作用最弱。
　　4.通过体内和体外实验均发现，NASH小鼠巨噬细胞中NF-κB的被激活入核，而该条通路可被11,12-EET所抑制，推断EET极有可能通过抑制巨噬细胞NF-κB的活化，减少其下游促炎因子的分泌，而在NASH的发生发展过程中发挥保护效应。

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第一章 环氧二十碳三烯酸（EET）对蛋氨酸胆碱缺乏（MCD）饮食诱导的小鼠脂肪性肝炎病程的影响及其相关机制研究

第一部分 EET对MCD饮食诱导的小鼠脂肪性肝炎病程的干预效应研究

摘要

前言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

第二部分 EET对MCD饮食诱导的小鼠脂肪性肝炎保护效应的相关机制研究

摘要

前言

材料与方法

结果

参考文献

第二章 体外高脂环境中EET对肝细胞损伤及巨噬细胞炎性分泌功能的影响及相关机制的研究

前言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

全文小结

综述

参考文献

附录

致谢