强磁场诱变选育提高Cunninghamella echinulataγ-亚麻酸产量的研究

摘要

多不饱和脂肪酸（Polyunsaturated fatty acids，PUFAs）在膳食、化妆品和医药领域有着重要的意义。γ-亚麻酸（γ-Linolenic acid，GLA）是重要的必需脂肪酸，其属于omega-6系不饱和脂肪酸，是具有18个碳原子，三个双键的直链脂肪酸，称为18:3n-6或6,9,12-十八碳三烯酸，顺-6，顺-9，顺-12-十八碳三烯酸。GLA在自然界少量存在孢子植物的油中，其主要来源是月见草种籽油，但难以满足市场需求。采用微生物发酵法生产GLA成为GLA的替代来源，产油真菌如Cunninghamella echinulata由于含有较高含量的PUFA，成为PUFAs的生产菌株。
　　本论文采用不同强度脉冲磁场对产油真菌Cunninghamella echinulata的孢子悬浮液进行诱变，稀释分离培养得到64株诱变株。通过尼罗红染色和荧光显微镜镜检，初筛出3株有望高产油脂的诱变株。对3株诱变株进行发酵复筛，与对照相比，3株诱变株Mut-29，Mut-15和Mut-64 GLA产量分别提高了45.68％，21.97％和20.94％，诱变株Mut-29生物量、油脂含量、油脂产量、GLA含量和GLA产量分别提高了4.55％,21.96％,26.21％,15.38和45.68％，为最佳诱变株。
　　进一步研究了碳氮源、C/N、培养温度、pH、金属离子、诱导物对突变株Mut-29生物量、油脂和GLA积累的影响，以8％葡萄糖，1％黄豆粉为基质，150rpm，28℃培养7天，诱变株Mut-29的生物量、油脂含量、油脂产量、GLA含量和GLA产量分别提高了7.88％，18.07％27.38％，1.28％和27.93％，GLA产量达到1311mg/L，在同样条件下，以0.5％硝酸钾代替1％黄豆粉，GLA产量达到1282mg/L，比对照高出29.07％；以葡萄糖为碳源、硝酸钾为氮源，C/N为50:1时，GLA产量最高，为1214mg/L，提高了29.70％；使用0.5％混合氮源GLA产量达到1225mg/L。pH对GLA产量影响不大，与对照相比，从pH5.0-6.5，Mut-29GLA产量增加了14.70％-41.94％。低温有利于GLA合成但影响菌体生长，不适合GLA生产。金属离子Mg2+，Zn2+和Fe2+对GLA合成稍有促进，但Zn2+抑制真菌生长和油脂积累。接种前加入诱导剂乙醇和甲醇，尽管GLA含量有提高，由于诱导剂抑制菌体生长和油脂积累而不利于GLA生产。
　　总之，强磁场诱变是一种有效的提高微生物油脂和GLA产量的诱变方法。得到的诱变株Mut-29是GLA稳产突变株。

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1 Introduction

1.1 Lipids

1.2 Polyunsaturated Fatty acids

1.3 Essential Fatty acids

1.4 Sources of EFAs

1.5 Oleaginous Organisms

1.6γ-Linolenic acid (GLA)

1.7 GLA Production by microbial fermentation

1.8 Improvement of PUFAs yield by mutations

2 Material and methods

2.1 Materials

2.2 Media

2.3 Methods

3 Results and Discussion

3.1 Screening of mutants by Nile red staining and fermentation

3.2 Time courses of growth and lipid accumulation of Mut-29

3.3 Influence of different factors on fungal biomass, lipid and GLA production

4 Conclusions

Acknowledgments

参考文献

Appendix 1. Materials and equipment used in this study

Appendix 2. Abbreviations