线虫肠细胞胞吞后循环转运的调节机制研究

摘要

细胞中胞吞和分泌途径协调作用维持一种动态平衡以调节细胞膜的物质组分。这种动态平衡对于细胞维持内环境稳态，快速反应以应对细胞外环境和细胞内代谢的变化具有很重要的意义。在秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）中的研究阐明了膜结构转运在生理和发育中的许多功能，并且在分子水平上解释了介导货物分选，囊泡出芽，膜结构的分裂和融合的很多基本机制。在本文中，我们用线虫的肠道作为研究模型，研究了从基底面向顶面的极性运输，顶面胞吞后循环转运和基底面胞吞后循环转运过程。我们鉴定了一些调节这些膜结构转运的重要蛋白。
　　在顶面侧，我们观察到了RAB-11标记的顶面循环内涵体结构（Apical recycling endosomes,AREs）从基底面向顶面的极性运输过程。八亚基蛋白复合物exocyst是AREs向顶面细胞膜栓系所必需的。Exocyst亚基SEC-15在从基底面向顶面的转运过程中被RAB-11动态募集。
　　不同于在顶面侧介导向细胞膜的栓系，exocyst在基底侧作用于内涵体小管之间的栓系/融合。在过去的十几年时间里，网格蛋白非依赖型内吞途径（clathrin-independent endocytic pathways，CIE）不断吸引大家的兴趣，越来越多通过CIE途径进入细胞的内源细胞膜（PM）蛋白被鉴定出来。尽管有越来越多的调节蛋白被鉴定出来参与CIE途径，但我们对这些蛋白的具体功能和相互作用关联的了解依然有限。在本文中，我们观测到一种独特的相互关联的具有动态特征的内涵体管状结构（endosomal tubules），这些结构对于包括hTAC，GLUT1和DAF-4等在内的一些CIE途径货物分子在肠细胞基底侧循环转运过程是必需的。SEC-10是八亚基蛋白复合物exocyst的一个亚基。SEC-10和其它一些exocyst亚基的功能缺失会破坏这种内涵体小管，使它们变成不同大小的圈状结构。
　　进一步研究表明，这些内涵体小管对Rab GTP酶RAB-10的失活敏感。RAB-10在新生小管的出芽、生长延伸直到与临近小管最终融合的过程中始终处在小管的顶端。并且，常激活型RAB-10突变（GTP-locked Q68L突变体）产生了更多的管状结构，显示出在小管顶端更强的点状分布。显性负相常失活型RAB-10突变体（GDP-locked T23N突变体）在细胞质中弥散分布，且导致分布有hTAC-GFP的大空泡的产生。在rab-10突变虫系或RAB-10(T23N)转基因虫系中很难观察到hTAC小管，说明了RAB-10GTP酶是从基底侧早期内涵体（BEE）出来的内涵体小管的出芽和生成所必需的。在sec-10突变虫系中，我们观察到内涵体小管延伸事件明显减少。虽然仍有RAB-10处在新生小管的顶端，但我们发现sec-10突变虫系中剩余的这些管状延伸事件的栓系/融合成功率下降了大约5倍。
　　另外，我们还发现微管骨架是hTAC小管稳定和RAB-10结构动力学所必需的，这说明了微管骨架在基底侧内涵体小管的形成中的重要性。
　　总之，我们阐述了Rab GTP酶RAB-10，exocyst亚基SEC-10和微管骨架通过协同作用，参与形成一种内涵体管状网络结构。我们认为RAB-10引导小管的生长，而SEC-10负责小管间的栓系/融合。我们的研究结果为CIE途径的调节过程提供了新的见解。
　　除了肠细胞，在线虫中进行膜结构转运研究的其它系统还有卵母细胞和早期胚胎。在sec-10突变虫系中，卵黄蛋白受体RME-2的胞吞后循环转运过程受阻，从而影响了卵母细胞对由肠细胞分泌的卵母蛋白YP170A的吸收。另外，我们发现SEC-10或exocyst复合物是受精后CAV-1小泡/皮质颗粒分泌所必需的，同时也是早期胚胎形成渗透性和通透性屏障所必需的。

目录

封面

声明

中文摘要

英文摘要

目录

1 绪论

1. 1 细胞膜结构的运输

1. 2 R ab蛋白

1. 3 Exo c ys t复合物

1. 4 线虫细胞内膜结构转运研究进展

1. 5 本文主要研究内容

2 实验原理和研究方法

2. 1 线虫基本操作

2. 2 分子生物学基本方法

2. 3 荧光显微镜与荧光成像

3 RAB-11和exocyst在线虫肠细胞顶面极性运输中的作用研

3. 1 引言

3. 2 材料与方法

3. 3 实验结果

3. 4 讨论

4 SEC-10与RAB-10协同作用参与线虫肠细胞基底侧胞吞后

4. 1 引言

4. 2 材料与方法

4. 3 结果

4. 4 讨论

5 SEC-10是线虫胚胎生长发育必需的

5. 1 引言

5. 2 实验材料与方法

5. 3 实验结果

5. 4 讨论

6 全文总结与展望

致谢

参考文献

附录1 攻读学位期间发表论文

附录2 主要符号和缩略词表