吸烟与不吸烟鼻息肉患者前列腺素E2受体表达差异在鼻息肉发病机制中作用的研究

摘要

第一部分不同类型慢性鼻窦炎患者前列腺素E2受体表达的比较研究
　　【背景和目的】
　　慢性鼻窦炎（Chronic rhinosinusitis，CRS）是上呼吸道一种常见的，多发的炎症性疾病，其发病机制不明。依据是否伴有鼻息肉将CRS分为两大类：不伴鼻息肉的慢性鼻窦炎（chronic rhinosinusitis without nasal polyps，CRSsNP）和伴鼻息肉的慢性鼻窦炎(chronic rhinosinusitis with nasal polyps，CRSwNP)。嗜酸性粒细胞炎症是白种 CRSwNP患者的炎症特点，但在中国患者中，超过一半的CRSwNP表现为非嗜酸性粒细胞性炎症。因此，CRSwNP又可分为嗜酸性CRSwNP（Eosinophilic CRSwNP，Eos CRSwNP）和非嗜酸性CRSwNP（noneosinophilic CRSwNP，non-Eos CRSwNP）。不同类型的CRS具有不同的组织重塑形式，并且与 CRS的炎症模式密切相关。研究表明，不同的免疫调节机制参与CRSsNP、non-Eos CRSwNP和Eos CRSwNP的发病。多项研究发现前列腺素E2（E-prostanoid，EP）受体在白种人阿司匹林不耐受三联征（Samter's triad）的发病机制中发挥作用。然而迄今为止，尚未发现关于中国CRS患者的EP受体表达的研究报道。本实验比较EP1、EP2、EP3和EP4受体在阿司匹林耐受的不同类型CRS患者（CRSsNP、non-Eos CRSwNP和Eos CRSwNP）中的表达，并探讨EP受体在CRS发病机制中的作用。
　　【方法】
　　鼻腔组织标本来自12例CRSsNP患者、16例non-Eos CRSwNP、12例Eos CRSwNP患者和12例对照组。普通光学显微镜下对HE染色组织切片进行观察，计算黏膜上皮下浸润的炎症细胞数和腺体数，对间质水肿程度进行评分。用免疫组织化学染色S-ABC法检测四种EP受体的组织表达。分别用Real-time PCR和Western blot技术检测不同组别中EP受体的mRNA和蛋白的表达。连续切片免疫组化染色检测EP和嗜酸性粒细胞阳离子蛋白（Eosinophil cationic protein，ECP），分析EP受体与嗜酸性粒细胞之间的关系。
　　【结果】
　　不同类型的CRS组织病理学特征各异。免疫组织化学染色显示EP受体主要表达于鼻黏膜上皮、腺体和上皮下炎症细胞。EP受体mRNA在组内的表达差异显示，对照组中EP4、EP2受体较EP3和EP1受体高表达，CRSsNP和non-Eos CRSwNP中EP4受体的表达明显增加，EP受体在这三组中的表达顺序为EP4>EP2> EP3>EP1；而Eos CRSwNP组EP2受体表达显著下调，EP1受体上调。EP受体组间比较显示，与对照组、CRSsNP和non-Eos CRSwNP相比较，Eos CRSwNP中EP1受体mRNA和蛋白表达均上调，而四组间EP2、EP3和EP4受体的表达无明显差异。对Eos CRSwNP行连续切片免疫组化染色示，EP1受体主要表达于上皮下炎症细胞，其中EP1阳性的嗜酸性粒细胞占EP1阳性总细胞数的50％。
　　【结论】
　　国人CRS患者EP1、EP2、EP3和EP4受体的表达存在差异，并且不同于白种人。Eos CRSwNP中EP1表达较non-Eos CRSwNP、CRSsNP和对照组显著增加。Eos CRSwNP中EP1的表达上调可能与大量的嗜酸性粒细胞等浸润有关。四种EP受体在不同类型CRS发病中的功能有待进一步研究。
　　第二部分主动吸烟和不吸烟鼻息肉患者EP受体表达的比较研究
　　【背景和目的】
　　鼻息肉（chronic rhinosinusitis with nasal polyps，CRSwNP）的发病机制不明，越来越多的研究认为 CRSwNP是受多种因素共同作用的结果。既往的研究发现息肉组织中EP受体参与CRSwNP的发病，而EP受体的表达受多种生理和病理性刺激的调控。吸烟是呼吸道炎症的一个主要的危险因素，在 CRSwNP发病中是否起作用尚存争议，但大多数研究认为吸烟引起或加重CRSwNP的炎症反应，其机制仍不明确。有研究表明香烟烟雾可以通过改变气道和外周血炎症细胞的EP受体的表达，进而促进炎症反应，但香烟烟雾对CRSwNP中EP受体表达的影响并不清楚。本实验将CRSwNP患者分为主动吸烟（Smoking CRSwNP，S-NP）组和不吸烟（Non-Smoking CRSwNP，N-NP）组，通过比较研究EP1、EP2、EP3和EP4受体在两组疾病组织中的表达的差异，探讨吸烟与EP受体的关系，从而进一步阐明吸烟与CRSwNP发生之间的关系。
　　【方法】
　　息肉标本来自21例S-NP和28例N-NP患者。分别对两组息肉组织切片行HE染色、Alcian blue杯状细胞染色、Masson胶原纤维染色和中性粒细胞髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）免疫组化染色。光学显微镜下观察S-NP组和N-NP组息肉标本组织病理学特点，计算鳞状上皮化生阳性率、上皮杯状细胞数，固有层中浸润的炎症细胞（嗜酸性粒细胞、MPO+中性粒细胞、单个核细胞）和腺体数，对间质水肿程度和基底膜厚度进行评分，纤维化水平以胶原纤维百分比表示。用免疫组织化学染色检测四种EP受体的组织表达。分别用Real-time PCR和Western blot技术检测息肉组织中EP受体的mRNA和蛋白的表达。
　　【结果】
　　N-NP组和S-NP组均可见上皮增生、杯状细胞增生、基底膜增厚、间质水肿、大量炎症细胞浸润（PMNs、单个核细胞等）。与N-NP组相比，S-NP组鳞状上皮化生率、杯状细胞计数、总炎症细胞计数显著增加。S-NP组间质胶原纤维百分率比例较N-NP组更高（P=0.07）。两组嗜酸性粒细胞计数、单个核细胞计数、基底膜厚度评分、黏膜下腺体数和间质水肿评分，无统计学差异。免疫组织化学染色示两组间EP受体亚型的表达定位相同。EP受体mRNA在组内的表达差异显示，N-NP组 EP2受体的表达显著低于 EP1、EP3和EP4受体（EP4>EP3>EP1>>EP2）；S-NP组中 EP2的相对低表达差异更明显（EP3>EP1>EP4>>EP2）。同一EP受体不同组间比较，S-NP组较N-NP组EP2、EP4受体mRNA和蛋白表达显著下调，而EP1和EP3受体表达无显著差异。
　　【结论】
　　S-NP组织炎性病变比N-NP组更加明显，香烟烟雾并未改变EP受体的组织定位。S-NP和N-NP组织中EP2的相对低表达可能与息肉形成有关。主动吸烟可能通过下调鼻黏膜组织中 EP2、EP4受体的表达，参与 CRSwNP的发生和发展。
　　第三部分主动吸烟和不吸烟鼻息肉患者组织和外周血中TNF-α和IL-6含量的比较研究
　　【背景和目的】
　　众多炎症介质与CRSwNP的发病机制关系密切。研究证实TNF-α、IL-6等细胞因子在鼻腔息肉组织或鼻分泌物中表达增加，在鼻息肉（chronic rhinosinusitis with nasal polyps，CRSwNP）的发病机制中发挥重要作用。我们前期工作中发现S-NP组织中EP2和EP4受体较N-NP组显著降低，S-NP的组织重塑如鳞状上皮化生、杯状细胞增生、间质纤维化程度比N-NP组更重，并且S-NP中炎症细胞浸润更加明显。提示吸烟因素可能通过改变呼吸道黏膜中EP受体的表达，介导靶细胞的活化促进炎症因子的广泛合成，进而参与CRSwNP慢性炎症的发生发展。吸烟对CRSwNP患者鼻腔组织局部和血清中细胞因子的影响鲜有报道。本部分实验进一步对比S-NP组和N-NP组息肉组织和血清TNF-α、IL-6的含量，并研究促炎因子的产生与吸烟指数（SI）是否有相关性。
　　【方法】
　　息肉和静脉血清标本来自21例主动吸烟（Smoking CRSwNP，S-NP）组，和28例不吸烟（Non-SmokingCRSwNP，N-NP）组。吸烟指数（smoking index，SI）计算方式为每天吸烟的包数x吸烟年限。采用酶联免疫吸附试验（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）分别检测不同组别息肉组织和血清中IL-6和TNF-α的水平，并与SI作相关性分析。
　　【结果】
　　S-NP组鼻息肉组织TNF-α含量比N-NP组显著增高，IL-6水平虽无统计学差异（P=0.06），但S-NP组表达水平更高。N-NP组和S-NP组血清TNF-α、IL-6浓度无显著差异。Spearman相关分析组织TNF-α和IL-6含量与SI均无相关性。
　　【结论】
　　S-NP息肉组织中促炎因子IL-6和TNF-α含量高于N-NP组，与S-NP的更重的炎性改变有关，与吸烟的强度可能无关。香烟烟雾是否通过降低EP2、EP4受体的表达，促进组织结构细胞或炎症细胞合成和释放IL-6和TNF-α等促炎因子，从而导致CRSwNP的发生发展，有待进一步研究。
　　第四部分主动吸烟和不吸烟鼻息肉患者PBMC中EP受体的表达及功能研究
　　【背景和目的】
　　人外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC）在多种炎症性疾病中发挥着重要作用，单个核细胞浸润是慢性炎症性疾病的病理特征之一。CRSwNP组织中单核细胞、淋巴细胞的聚集增加，与趋化因表达显著增高有关。研究表明单核/巨噬细胞中EP1、EP2、EP3和EP4受体均有表达，而且受病理生理机制调控。我们前期研究发现EP受体广泛表达于息肉组织中浸润的炎症细胞，吸烟鼻息肉组织中EP2、EP4受体的表达降低，可能与 CRSwNP的炎症反应有关。吸烟是否影响CRSwNP患者PBMC中EP受体的表达进而影响单个核细胞的功能，目前尚无相关的报道。本实验中，我们比较S-NP组和N-NP组PBMC的EP受体表达的差异，并进行PBMC体外香烟烟雾提取物（cigarette smoke extract，CSE）刺激实验，明确香烟烟雾是否诱导PBMC的EP受体表达变化，并促进PBMC释放促炎因子。
　　【方法】
　　1.静脉血标本来自21例主动吸烟（Smoking CRSwNP，S-NP）组，和28例不吸烟（Non-Smoking CRSwNP，N-NP）组。用 Ficoll密度梯度离心法提取PBMC。分别用Real-time PCR和Western blot技术检测并比较两组PBMC中EP受体的mRNA和蛋白的表达。
　　2.细胞体外刺激实验血液标本采自6例N-NP患者，用Ficoll密度梯度离心法提取PBMC。用不同浓度CSE（0%、0.1%、1%、10%）刺激体外培养的PBMC24小时，分别用Real-time PCR和Western blot技术检测不同浓度组PBMC中EP受体mRNA和蛋白的表达。采用酶联免疫吸附试验（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）分别检测不同浓度CSE组上清中TNF-α、IL-6含量。
　　【结果】
　　1. PBMC的EP受体mRNA在S-NP组内的表达显示，EP4受体表达显著高于EP1、EP2和EP3受体，EP2受体表达显著高于EP1和EP3，而EP1和EP3 mRNA的表达无统计学差异（EP4>>EP2>>EP1>EP3）。N-NP组内的EP受体表达与S-NP组相似。S-NP组和N-NP组组间比较EP受体（mRNA和蛋白）的表达均无统计学差异。
　　2.细胞体外刺激实验Real-time PCR结果
　　不同浓度的CSE（0.1%、1%、10%）刺激PBMC细胞24小时后，EP1、EP2、EP3和EP4受体mRNA的表达变化如下。
　　2.1 EP1受体mRNA的表达与对照组相比均显著增加（P<0.05）。
　　2.2 EP2受体mRNA的表达与对照组相比均降低，统计学分析显示10%CSE组与对照组相比有显著差异（P<0.05）。
　　2.3 EP3受体mRNA的表达与对照组相比均增加，统计学分析显示CSE（1%、10%）组与对照组相比有显著差异（P<0.05）。
　　2.4 EP4受体mRNA的表达与对照组相比均显著降低，统计学分析显示1%CSE（P<0.05）和10%CSE组（P<0.01）与对照组相比有显著差异。
　　3.细胞体外刺激实验Western blot结果
　　3.1 EP1受体蛋白条带的灰度值随CSE浓度增加逐渐增强，10%CSE组与对照组相比显著增强（P<0.05）。
　　3.2 EP2受体蛋白条带的灰度值显示10%CSE组与对照组相比显著减弱，0.1%CSE、1%CSE与对照组相比无明显差异（P<0.05）。
　　3.3 EP3受体蛋白条带的灰度值10%CSE组与对照组相比显著增强，有显著差异（P<0.05）。
　　3.4 EP4受体蛋白条带的灰度值1%CSE、10%CSE组与对照组相比显著减弱（P<0.05）。
　　4.细胞体外刺激实验 ELISA检测结果
　　与对照组相比，不同浓度CSE（0.1%、1%、10%）刺激PBMC24h后TNF-α、IL-6含量呈剂量依耐性升高。1%CSE和10%CSE刺激组上清中TNF-α、IL-6含量与对照组相比有统计学差异。
　　【结论】
　　S-NP和N-NP组间PBMC的EP受体表达无明显差异，S-NP的EP受体表达下调可能限于组织局部。CSE通过上调N-NP患者PBMC中EP1和EP3受体的表达，下调EP2和EP4受体，促进PBMC的活化并生成TNF-α和IL-6。

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华中科技大学博士学位论文创新点概述

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主要中英文缩略词表

引言

参考文献

第一部分不同类型慢性鼻窦炎患者前列腺素E2受体表达的比较研究

中文摘要

Abstract

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

第二部分主动吸烟和不吸烟鼻息肉患者EP受体表达的比较研究

中文摘要

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前言

方法

结果

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结论

参考文献

第三部分主动吸烟和不吸烟鼻息肉患者组织和外周血中TNF-α和IL-6含量的比较研究

中文摘要

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前言

方法

结果

讨论

结论

参考文献

第四部分主动吸烟和不吸烟鼻息肉患者PBMC中EP受体的表达及功能研究

中文摘要

ABSTRACT

前言

方法

结果

讨论

结论

参考文献

总结

综述: 前列腺素E2及前列腺素E2受体在慢性鼻窦炎发病机制中的研究进展

致谢