钙调控蛋白与核因子κB在MDMA急性染毒心肌细胞钙失衡作用的研究

摘要

目的：
　　MDMA在世界范围内流行，其毒性研究已受到广泛关注，是法医学关注的焦点之一。吸食和滥用MDMA可引起包括心动过速、室性心律失常，并引起心肌细胞形态学的病理性改变，如扩张性心肌病、肥厚性心肌病样改变，引起猝死等，表明心脏亦是MDMA的毒性作用靶器官之一。MDMA可引起心肌细胞内的钙超载及振荡模式改变、核因子κB的活化，基于此，在本课题中，我们研究了不同浓度MDMA急性染毒时细胞内钙离子浓度及钙振荡模式的变化特征及差异，并观察涉及维持细胞内钙离子稳态的钙调控蛋白在MDMA致心肌细胞钙超载中的作用，以及NF-κB活化的可能途径及其对钙调控蛋白的影响，进一步探讨MDMA致心肌毒性的作用机制。
　　方法：
　　实验1：
　　1.采用原代大鼠心肌细胞体外培养，至培养第6d时，建立MDMA急性染毒模型及对照组，染毒组分为10μmol、100μmol及1000μmol三组，染毒1h后，观察其形态变化，测定其细胞毒性；
　　2.在细胞培养第6天，使用负载Fluo4-AM的荧光染液，利用激光共聚焦显微镜观察染毒心肌细胞内钙信号的变化特征。
　　实验2：
　　采用原代大鼠心肌细胞，于体外培养第6d染毒，提取细胞总蛋白及总RNA，使用蛋白免疫印迹法及荧光实时定量 PCR法检测 RyR2、SERCA2a、PLN、NCX1及Cav1.2（CACNA1c）的蛋白及基因表达变化。
　　实验3：
　　1. EMSA法检测MDMA染毒组、PDTC（NF-κB抑制剂）干预组及CHE（PKC抑制剂）干预组，观察各组中NF-κB的活性变化。
　　2.提取各组中核蛋白及总蛋白，观察p-p65（Ser311）的含量变化，并观察PKCζ的含量变化。
　　3.利用激光共聚焦技术，观察 PDTC干预后，MDMA染毒对心肌细胞内钙信号的变化情况。
　　4.提取MDMA染毒及PDTC干预组的总蛋白及总RNA，使用蛋白免疫印迹法及荧光实时定量PCR法检测PDTC干预后，MDMA染毒时RyR2、SERCA2a、PLN、NCX1及Cav1.2（CACNA1c）的蛋白及基因表达变化。
　　结果：
　　1. MDMA染毒后心肌细胞形态未见明显改变，部分可见细胞搏动减缓，LDH法测定结果显示各浓度MDMA急性染毒组与正常心肌细胞对照组之间无明显差异。
　　2.空白对照组Ca2+振荡波形为不规则状波动，但总体振荡幅度小，未见明显的大幅波动，相对光密度值变化较小，而在MDMA急性染毒组，可见胞浆内Ca2+振荡波形呈不规则改变，振荡波动波幅增大，搏动振荡剧烈，频率不规则，相对光密度值波动幅度增大，部分波宽有所增加，但各浓度之间未见明显的差异。
　　3. MDMA染毒时，心肌细胞内的RyR2、SERCA2a及NCX1的蛋白及基因表达均上调，而LTCC通道、PLN的蛋白及基因表达下调，且有剂量依赖性。
　　4. EMSA法显示MDMA染毒时，NF-κB活性增加，并可被PDTC及CHE抑制。
　　5.在MDMA染毒组中，PKCζ及核内p-p65（Ser311）含量均有所上升，并可被CHE抑制。
　　6. PDTC干预、阻断NF-κB后，激光共聚焦显微镜观察细胞内钙离子信号变化，可见钙振荡波幅较染毒组减低。
　　7. PDTC干预、阻断NF-κB后，RyR2及SERCA2a、NCX1 mRNA及蛋白表达较MDMA染毒时有所下降，PLN无明显变化，而Cav1.2（CACNA1c）的表达上调。
　　结论：
　　1. MDMA可以导致心肌细胞内钙信号的变化，钙离子浓度升高，参与MDMA心肌毒性。
　　2. MDMA致心肌细胞内钙超载的机制，与心肌细胞内钙调控蛋白的变化有关，其中主要是与RyR2的表达上调有关。
　　3. MDMA可以通过PKCζ-NF-κB途径使细胞内NF-κB活性上调。
　　4. NF-κB活化后，可对心肌细胞内的钙调控蛋白发挥作用，整体上加剧细胞内钙离子超载。

目录

声明

主要缩略语英汉对照

引言

第一部分不同浓度MDMA急性染毒对大鼠心肌细胞内钙信号及钙稳态的影响

前言

1. 材料与方法

2. 结 果

3. 讨 论

4. 小 结

5. 参考文献

第二部分不同浓度MDMA急性染毒对大鼠心肌细胞内钙调控蛋白的影响

前言

1. 材料与方法

2. 结 果

3. 讨 论

4. 小 结

5. 参考文献

第三部分NF-κB对MDMA急性染毒心肌细胞内钙调控蛋白的影响

前言

1. 材料与方法

2. 结 果

3. 讨 论

4. 小 结

5. 参考文献

课题小结

创新点

研究展望

综述:心肌细胞中钙调控蛋白与钙稳态

附录

致谢