细胞色素P450表氧化酶2J2及其代谢产物EETs对细菌脂多糖诱导的急性肺损伤时血管渗透性的影响及其机制研究

摘要

研究背景和目的：急性肺损伤(acute lung injury，ALI)是各种致病因素损伤肺泡上皮细胞及微血管内皮细胞，细胞间连接遭受破坏，所造成的以弥漫性间质性肺水肿为主要病理特征，以急性低氧性呼吸功能不全为主要临床特征的综合征，是老年住院患者主要的死亡原因之一。尽管我们普遍认为脓毒血症的病理过程涉及多种炎性细胞的激活、炎性介质的释放以及凝血因子的活化，但最终最直接的死亡原因是其导致的急性肺损伤引起的呼吸窘迫，目前除了机械通气以外，临床尚没有有效的治疗手段，其根本原因是我们对其发病机制缺乏充分的认识。开发出针对脓毒血症性肺损伤的新型有效的治疗方式需要我们对其进行深入的探索和研究。内皮屏障的完整性是脓毒血症急性肺损伤预后的决定性因素，因此改善脓毒血症性肺损伤预后的关键在于维持内皮屏障的稳定性。血管内皮钙黏蛋白VE-cadherin（vascular endothelial cadherin）是内皮细胞与细胞间粘着连接（adherent junction）的主要结构基础，它是一种跨膜受体，其胞外区域与邻近细胞的VE-cadherin相结合，胞内区域通过一系列肌动蛋白结合蛋白（(α,β,γ and p120 catenins)铆定到细胞骨架MLC(myosin light chain，MLC)上。VE-cadherin的磷酸化和内化，细胞骨架MLC重排产生应力纤维诱导的向心力，最终使相邻细胞分开是增加细胞间渗透性的基本方式。任何能够抑制 VE-cadherin以及MLC磷酸化的分子都能够减轻炎症介质诱导的血管渗透性增加。表氧化二十碳三烯酸（Epoxyeicosatrienoic Acid,EETs）是花生四烯酸（Arachidonic acid,AA）的细胞色素P450表氧化酶(CYP450)代谢产物，其在多种病理状态中均表现出血管保护作用，但关于其是否能增强血管内皮屏障功能及其可能的分子生物学机制尚不得而知。之前关于脓毒血症性肺损伤时肺组织中的炎细胞浸润以及液体渗出情况的研究，大多数将焦点集中在炎症或者炎细胞本身生物学特性的改变，而少有从内皮细胞的角度探索炎细胞浸润的分子机制，而本研究主要是为了探索细胞色素P450表氧化酶2J2（CYP2J2）系统对血管渗透性的影响及其机制。
　　研究方法：在动物实验部分，选取8-12周的雄性CYP2J2过表达以及周龄相匹配的同窝野生型小鼠，随机分成四组：野生组(WT,给予生理盐水腹腔注射)、LPS组（给予细菌脂多糖LPS10mg/kg腹腔注射）、CYP2J2组（给予生理盐水腹腔注射）、CYP2J2+LPS（给LPS10mg/kg腹腔注射）；除了使用转基因鼠以外，我们还使用EET代谢酶sEH的抑制剂TPPU给小鼠灌胃以进一步证实CYP2J2系统对LPS诱导的血管渗透性的影响。在细菌脂多糖LPS处理后6小时：部分小鼠通过尾静脉以2mg/100g的浓度注射伊文思蓝（Evans blue）染液，1小时之后，通过右心室灌洗清除血管内残留的伊文思蓝，然后取出肺拍照、匀浆经甲酰胺处理后测OD值；部分小鼠行支气管肺泡灌洗，收集灌洗液，离心后取上清检测总蛋白浓度以及相关炎症因子的表达；部分小鼠取出肺组织，或制备石蜡切片，或于-80冻存以备后续的髓过氧化物酶（MPO）活性检测以及western检测。
　　在细胞实验部分，我们使用 LPS诱导脐静脉内皮细胞-细胞间发生结构改变，使用sEH抑制剂AUDA来预处理以观察AUDA诱导的内源性EETs增加对LPS诱导的内皮细胞间连接成分改变的作用及其具体的可能的分子生物学机制。
　　一：探讨CYP2J2在内皮细胞中特异性高表达以及sEH抑制剂TPPU对小鼠脓毒血症性急性肺损伤时血管渗透性的作用
　　1.观察腹腔注射LPS后120小时内死亡率，绘制生存曲线
　　2. HE染色：观察肺间质炎细胞浸润情况
　　3. MPO免疫组化：观察肺间质中性粒细胞的浸润情况
　　4. MPO活性检测：肺间质中性粒细胞的浸润情况
　　5.伊文思兰染色和肺泡灌洗液的蛋白浓度测定：检测蛋白的跨血管渗出情况
　　6.肺湿重干重比：检测血浆液体的跨血管渗出情况
　　7.免疫荧光：NG2、CD31免疫荧光染色观察血管周细胞的数量
　　二、sEH抑制剂AUDA对内皮连接成分的作用其机制
　　1. FITC-右旋糖苷 transwell:检测AUDA对LPS诱导的内皮细胞单层渗透性增加的调节作用
　　2. Western blot:检测VE-cadherin的可溶成分和不可溶成分的转换
　　3. Western blot:检测 VE-cadherin和MLC的磷酸化修饰
　　4.流式细胞术：检测对LPS对内皮细胞凋亡的作用
　　三、AUDA调节内皮渗透性的机制探索
　　1. ROCK在AUDA调节内皮渗透性中的作用
　　2.氧化应激在AUDA调节ROCK介导的渗透性变化中的作用
　　3. Src激酶在AUDA调节内皮渗透性中的作用
　　4. Src激酶对LPS诱导的氧化应激的作用
　　研究结果：
　　一、 CYP2J2在内皮细胞中特异性高表达缓解了小鼠脓毒血症性急性肺损伤时血管渗透性的增加
　　1. CYP2J2内皮细胞特异性高表达降低了LPS脓毒血症所致的死亡率
　　2. CYP2J2内皮细胞特异性高表达降低了脓毒血症性急性肺损伤所致的肺间质中炎细胞尤其是中性粒细胞的浸润
　　3. CYP2J2内皮特异性高表达降低了脓毒血症性急性肺损伤所致的肺间质液体渗出
　　4. CYP2J2内皮特异性该表达降低了脓毒血症性急性肺损伤所致的肺泡腔蛋白的渗出
　　5. CYP2J2内皮特异性该表达抑制了脓毒血症性急性肺损伤所致的血管周细胞的丢失
　　6. sEH抑制剂TPPU抑制了小鼠急性肺损伤时的血管渗透性增加
　　二、 sEH抑制剂AUDA对内皮连接成分的作用其机制
　　1. AUDA减少了LPS所致的FITC标记的右旋糖酐的跨内皮渗出
　　2. AUDA减少了LPS所致的VE-cadherin由不可溶形式向可溶形式的转化
　　3. AUDA减少了LPS所致的细胞连接成分的磷酸化修饰
　　4.以上AUDA对内皮屏障的维持作用并不是由减少细胞凋亡来实现的
　　三、AUDA调节内皮渗透性的机制探索
　　1. AUDA是通过Rho-ROCK来调节内皮渗透性的
　　1) AUDA减少了LPS诱导的Rho活性增加
　　2) AUDA减少了LPS诱导的Rho下游分子ROCK活性的增加，即减少了mypt（肌球蛋白磷酸酶）的磷酸化
　　2. AUDA是通过调节ROS生成来调节Rho-ROCK介导的内皮渗透性改变的
　　1)氧化应激清除剂NAC减少了LPS诱导的ROS生成，缓解了LPS诱导的内皮渗透性增加
　　2)氧化应激清除剂NAC可以缓解LPS诱导的Rho-ROCK活化
　　3) AUDA可以减少LPS诱导的ROS生成以及NOX2表达，与NAC作用相似
　　4) AUDA缓解了H2O2直接诱导的渗透性改变，与NAC作用相似
　　3. AUDA是通过调节GRP78与Src结合触发的Src活化来调节内皮渗透性的
　　1) AUDA减少了GRP78与Src的结合以及Src的活化
　　2) Src抑制剂PP1缓解了LPS诱导的内皮渗透性增加
　　3) Src抑制剂PP1缓解了LPS诱导的细胞连接成分(VE-cadherin)以及细胞骨架成分（MLC）的磷酸化
　　4. GRP78与Src结合触发的Src活化作用于ROS上游
　　1) Src抑制剂PP1缓解了LPS诱导ROS生成
　　2) Src抑制剂PP1缓解了LPS诱导NOX2表达
　　3) Src抑制剂PP1缓解了LPS诱导ROCK活化
　　结论：
　　一、 CYP2J2可以降低脓毒血症性肺损伤，降低死亡率，抑制脓毒血症性急性肺损伤所致的血管渗透性增加
　　二、 CYP2J2可以减少细胞粘着连接成分 VE-cadherin的磷酸化，以及细胞骨架MLC的磷酸化，从而减少细胞连接的开放
　　三、 CYP2J2稳定内皮细胞间粘着连接的作用是通过抑制GRP78介导的Src活化，减少ROS生成，从而降低Rho-ROCK通路的活化来实现的关于AUDA如何调控GRP78与Src相互作用的机制，待后期实验进一步探讨。

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英文摘要

研究背景

第一部分动物实验

材料方法

一、 实验试剂及材料

二、动物的饲养与管理:

三、碱法提取小鼠总DNA

四、PCR鉴定

五、生存曲线监测：

六、肺湿重干重比：

七、血浆 EETs含量测定

八、 Evans蓝染色

九、髓过氧化物酶活性检测（ MPO）

十、HE染色

十一、免疫组化

十二、免疫荧光

十三、小鼠冰冻肺组织提取蛋白质行 Western Blot检测蛋白质表达水平，

十四、支气管肺泡灌洗：

十五、统计学分析

实验结果

一、 内皮特异性 2J2过表达缓解了脓毒血症性肺损伤所致的血管渗透性增加

二、sEH抑制剂 TPPU缓解了脓毒血症性肺损伤所致的血管渗透性增加

结论

第二部分细胞实验

材料方法

一、 实验材料和仪器

二、 细胞准备

三、 细胞跨膜渗透性检测：

四、 可溶性蛋白（ Soluble）与不可溶性蛋白(Insoluble)的提取

五、 Rho-GTP活性检测

六、 免疫共沉淀[19]

七、 Western blot

八、 活性氧测定

九、 凋亡流式细胞术

实验结果

一、AUDA对内皮单层渗透性的作用

二、AUDA调节内皮渗透性的机制探索

结论

讨论

参考文献

综述: 急性肺损伤

附录

致谢