人工合成小分子双链RNA通过激活p21基因的表达对膀胱癌细胞的抑制作用

摘要

本文主要从以下几个部分展开论述：
　　第一部分 外源性和内源性小分子dsRNA对膀胱癌细胞中p21蛋白激活表达能力的比较
　　目的：人工合成分别与miR-1236-3p、miR-370-5p所作用的p21基因启动子序列区域完全互补配对的8对小分子dsRNA: dsP21-242、dsP21-243、dsP21-244、dsP21-245和 dsP21-552、dsP21-553、dsP21-554、dsP21-555，分别观察其与miR-1236-3p、miR-370-5p在上调人膀胱癌细胞系（ T24和 EJ）中抑癌基因p21WAF1/CIP1表达能力的不同。
　　方法：8对 dsRNA通过参照 saRNA的设计原则设计合成。分别转染 dsControl（阴性对照）、miRNA（阳性对照）及对应的dsRNA至T24和EJ细胞，通过qPCR、RT-PCR和Western blot分别检测p21 mRNA和p21蛋白表达水平。
　　结果： qPCR检测显示 dsP21-245和 dsP21-555均能明显促进两种细胞中 p21 mRNA水平的升高；与dsControl组相比，dsP21-245分别促进T24和EJ细胞中p21 mRNA的表达至2.32倍（P<0.01）和2.84倍（P<0.001）；与miR-1236-3p组相比，dsP21-245分别在T24和EJ细胞中p21 mRNA表达的差异均没有统计学意义（P>0.05）；与dsControl组相比，dsP21-555均能明显促进T24和EJ细胞中p21 mRNA的高表达（P<0.001，P<0.001）；与miR-370-5p组相比，dsP21-555分别在T24和EJ细胞中p21 mRNA表达的差异均没有统计学意义（P>0.05）。通过RT-PCR得到了进一步验证。蛋白质印迹法提示，在T24和EJ细胞中，p21蛋白表达变化与p21 mRNA表达变化一致。与dsControl组相比，其余6对dsRNA均未能同时显著上调两种细胞系中p21WAF1/CIP基因的表达(P>0.05)。
　　结论：外源性的dsP21-245和dsP21-555能显著促进膀胱癌细胞中p21WAF1/CIP1的高表达，且与相应的内源性miRNA激活p21WAF1/CIP1表达的能力无明显差异。
　　第二部分 外源性dsRNA通过激活p21蛋白的表达抑制膀胱癌细胞生长
　　目的：通过转染外源性dsP21-555至膀胱癌细胞T24和EJ中，观察其能否抑制膀胱癌细胞的生长。
　　方法：分别转染dsControl（阴性对照组）、miR-370-5p（阳性对照组）和dsP21-555（实验组）至膀胱癌细胞系T24和EJ。通过qPCR检测p21 mRNA和CDK4/6 mRNA的表达变化。通过蛋白质印迹法检测p21蛋白和CDK4和CDK6蛋白的表达。通过流式细胞术检测三组中细胞周期分布。MTS法检测三组中细胞增殖能力。集落形成实验检测三组中单个细胞克隆增殖能力。
　　结果：qPCR结果显示，与阴性对照组dsControl相比，dsP21-555分别促进T24和EJ细胞中p21 mRNA表达至2.46倍（P<0.01）和2.60倍（P<0.001）；与miR-370-5p相比，T24和EJ细胞中p21 mRNA表达的差异均无统计学意义（P>0.05）；与阴性对照组dsControl相比，dsP21-555组T24和EJ细胞中CDK4 mRNA的表达下调至0.57倍（P<0.001）和0.46倍（P<0.01），CDK6 mRNA的表达下调至0.61倍（P<0.01）和0.64倍（P<0.01）；与 miR-370-5p相比，T24和EJ细胞中CDK4和CDK6 mRNA表达的差异均没有统计学意义（P>0.05）。蛋白质印迹法提示，p21和CDK4及CDK6蛋白表达变化与相应mRNA表达变化一致。FCM检测显示，与阴性对照组 dsControl相比，转染 miR-370-5p或dsP21-555后，处于G0/G1期的细胞比例明显上升，而处于S期和G2/M期的细胞比例下降，表明细胞周期被阻滞在G0/G1期。MTS法显示，与dsControl相比，转染 miR-370-5p或 dsP21-555后细胞增殖能力均明显减弱（ P<0.05），但与miR-370-5p相比，dsP21-555组细胞增殖能力无明显变化（P>0.05）。细胞集落形成实验显示，阳对对照组 miR-370-5p和实验组 dsP21-555形成的集落数数量均较阴性对照组dsControl少。
　　结论：外源性dsP21-555能激活p21蛋白的表达，具有对膀胱癌细胞生长的抑制作用。

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第一部分 内源性和外源性小分子dsRNA激活膀胱癌细胞p21 WAF1/CIP1表达作用的比较

前言

材料和方法

结果

讨论

参考文献

第二部分 外源性小分子dsRNA通过激活p21WAF1/CIP1对膀胱癌细胞的抑制作用

前言

材料和方法

结果

讨论

参考文献

综述: RNA激活在膀胱癌中的研究进展

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